园艺植物的生物技术研究完整版

园艺植物研究法园艺植物的生物技术研究生物技术•

以满足人类不同层次生活需求为目的的对生命活

动形式的研究、探索、改造、利用的所有相关技

术都属于生物技术的范畴。•

生物技术产业特征：高投入、高效益、短周期

•

生物技术的主要类型：细胞工程、基因工程、酶工程、发酵工程、代谢工程细胞工程应用细胞生物学和分子生物学的方法，在细胞

水平进行的遗传操作。包括快繁、脱毒、细胞

培养、花药培养、原生质体培养及融合等

组织培养成功的植物已超过600种；

花药培养再生的植物超过200种；

原生质体培养成功的植物超过100种基因工程人类按照设计，将某种生物的基因分离出来，

借助基因重组技术与载体分子组成重组DNA，

或采用直接导入的技术，将目的基因引入受

体细胞，使后者迅速、定向地获得新的遗传

性状或成为一种新型的生物物（品）种分为动物基因工程、植物基因工程、微生物

基因工程和病毒基因工程二、园艺植物生物技术研究园艺植物生物技术的种类、应用和

研究方法。提纲2.1

园艺植物组织培养及其应用2.2

原生质体培养、再生、融合技术

2.3

分子标记的应用2.4

基因工程2.1

园艺植物组织培养•

在离体条件下，使园艺植物的

某一器官、组织或细胞增殖和

再生的技术。•

这一技术的理论基础是植物细

胞的全能性假说。植物细胞的全能性假说/植物组织培养的要素外植体无菌操作培养基诱导、培养、再生条件植物组织培养的关键环节

1、实验室建设2、培养基的选择及培养基配制3、接种所用的材料与材料的接种方法

4、激素的使用与培养物的再生5、试管苗的生根与移栽实验室建设•

实验室：培养基准备室、接种室、培养室、观

察分析室。•

设备：灭菌锅、超净工作台、天平和显微镜。

•

要求：接种室和超净工作台提供一个无菌的条件。培养室要求温度恒定，一般是25－28℃，

光照时数和强度可控。培养基的选择及配制•

培养基：为外植体生长提供碳素营养、水份、

矿质元素、激素、维生素及其它有机营养的介

质。按状态分为液体培养基和固体培养基两类。•

激素的使用：培养基中常常要加入植物（外源）

激素才能使外植体产生愈伤组织或启动分裂。培养基的主要成分及种类

大量元素：N、P、K、Mg、Ca、Fe（与EDTA螯合）

微量元素：I、Cu、Mo、Zn、CoB族维生素、维生素C、甘氨酸、肌醇、激素培养基的配制1)母液配制•

N、P、K、Mg、Ca盐按顺序配在一起，浓度为使用时的10倍•

Fe盐常与EDTA（乙二胺四乙酸钠）配在一起，配成100倍母液

•

微量元素（I、Cu、Mo、Zn、Co）、B族维生素、维生素C、甘氨酸、肌醇分别配成100倍。2)激素类根据使用浓度，可配成100倍左右的母液。3)

母液保存在4℃冰箱中，可使用1-2个月。4)园艺植物常用的基本培养基：MS，Murashige和Skoog于1962

年为烟草细胞培养设计，适用于蔬菜、花卉的组织培养；

MT，

适用于柑橘的组织培养。培养基的配制5）使用前，取母液稀释、加入蔗糖，定容后测定pH值。

pH值在5.8-6.0之间；<

5.8，固体培养基偏软；>

6.0，固体培养基偏硬。•

过酸或过碱时，分别用1N

NaOH或1N

HCl调至所需的值•

培养基配成固体时，应加入0.6~1.0％的琼脂如配置液体培养基，则不需加入琼脂•

pH值调整好后直接分装，，高压湿热灭菌，1.05kg/cm2，

120℃，15-20min灭菌•

培养基常温放置几天确保无菌后，再使用••材料的接种外植体：组培过程中所使用的材料称为外植体－Explant

消毒－－采用理化方法杀灭微生物的方法。外植体的消毒：必须经过表面消毒将微生物杀死后才能接种。

否则造成污染。先将材料用自来水洗净，在75%的酒精

中浸30秒钟左右，转入5－15%的次氯酸钠中浸泡5－10

分钟，最后用消毒后的蒸馏水洗涤材料3－5次。•

消毒后的材料，根据需要，用灭过菌的器械将其分离或切

割，然后接入到培养基中。激素的类型作用：使外植体产生愈伤组织或启动分裂••生长素类（Auxins）：NAA（萘乙酸）、2,4-D（2,4-二氯

苯氧乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）等

细胞分裂素（CTK）：常用的是6-BA（6-苄基腺嘌呤）、KT（激动素）、ZT（玉米素）等•赤霉素：较少应用，促进试管苗的生长。细菌过滤器消毒：

经过一层微孔滤膜（0.22~0.45

μm)。

微生物不能通过滤膜。用于酶液和激素的消毒。激素的比例•

生长素/细胞分裂素对形态分化极其重要比例高时有利于生根----生根培养基比例低时有利于芽的分化----生芽培养基比例处于平衡时有利于愈伤组织的生长----基本培养基

因物种不同，激素的绝对比例有所不同。e.g.柑橘2,4-D

1.5

+

NAA

1.0

+

KT

0.15

+

ZT

0.10(mg/L)－－愈伤及愈伤继代

KT

0.5

+

6-BA

0.5

+

NAA

0.1(mg/L)－－分化芽NAA

1.0(mg/L)－－分化根培养物再生成植株的方式

1.

胚状体途径：培养物先产生愈伤组织，然后产生类似于胚的结构（胚状体）。或直接产生胚状体。后者能象

种子那样萌发成苗，产生的量大，再生植株的变

异较小。柑橘的胚状体是由单细胞起源，产生嵌

合体的机会少，在快繁及遗传育种中有具有重要

的价值。2.

器官发生途径：先分化出茎芽，然后再形成根成

为完整植株。

愈伤组织(callus)产生芽时，一般是多细胞起源，容易产生嵌合体和变异(变异筛选)芽苗的生根•

园艺植物组培时常得到无根的芽苗（丛芽），移栽

前必须诱导生根。•

诱导生根方式：（1）降低培养基盐浓度；（2）配合使用生长素IBA、NAA等；（3）添加吸附剂，如活性炭（4）可采用试管嫁接的方法使其成为完整植株。伤口愈合

长出新叶时，可移栽。移栽和炼苗•

组培苗从半自养到全自养的适应过程•

移栽前加强光照，使幼苗充实和木质化•

或将培养基中糖的浓度降低，减少无机盐浓度•

经过2周左右，将试管盖揭开，放在散射光下，

自然温度（高温和严冬除外）中锻炼1~2周。园艺植物组织培养的应用

（一）快速繁殖和脱毒技术（二）为获得倍性水平不同的材料而进行的组织

培养――倍性育种（三）胚抢救（四）试管开花与花芽分化机理研究（五）提供选、育种新资源（一）快速繁殖和脱毒技术

快繁在短期内，使园艺植物个体增殖到常规方法难

以达到的数量。它是将园艺植物的茎尖或其它

器官在人工培养基中使其快速增殖成许多植株

的过程。脱毒园艺植物生产中需要的不仅是优良的种苗，而

且是无病毒的种苗。因此，人们往往在快速繁

殖的同时，结合了病毒脱除的程序。最后，繁

殖出来的是无病毒种苗。•

我国快速繁殖植物的种类达443种之多•

非洲紫罗兰叶片扦插年繁殖3.4倍，而用组织

培养方法，年繁殖可达10万倍以上•

康乃馨、月季、兰花、牡丹、香石竹、唐菖蒲、

无籽西瓜、菠萝、桉树以及扦插难以成活的菊

花的名贵品种。•

香蕉、葡萄等工厂化育苗基地的建立，每年可

生产上万株种苗，节省了土地资源和能源消耗。病毒脱除•

采用的茎尖大小有严格的要求。如柑橘茎尖的

大小应控制在0.14~0.18mm为宜。这一范围的

茎尖由于输导组织还未分化，病毒未到达茎尖。•

柑橘的茎尖不易培养成植株，要采用茎尖微芽

嫁接方法（STG．Shoot-tip

grafting

）以获

得无病毒苗•

在实际应用时把热处理、茎尖培养和微芽嫁接

技术结合起来，以提高脱毒的效率。病毒蛋白

质外壳的转基因技术也可以用于病毒脱除中。摸索添加激素的条件如，摸索细胞分裂素(6-BA)，与生长素IAA、

IBA、NAA的浓度配合。方法1：第一步可将浓度梯度设得较大，如0，

2，4，6，8，10mg／L；第二步再将浓度细化。

方法2：可采用正交试验设计。方法3：根据前人的结果，进行浓度的上下调

动，或将几个最佳激素配比进行对比试验。摘要:

以猴耳环成熟的种胚无菌萌发小苗为外植体,

研究不同

种类及浓度的植物生长物质对丛芽诱导增殖和植株再生的影

响,

建立完整的离体快繁体系。结果表明,

猴耳环种胚最佳灭

菌方式为0.1%

HgCl2处理12

min,

污染率16.10%,

无菌萌发率

78.66%;

丛芽初代诱导最佳培养基为MS+6-BA

0.5

mg·L-1,

诱导

率100%;

继代增殖最适宜的培养基为MS+6-BA

0.7

mg·L-1+NAA

0.05

mg·L-1+IBA

0.3

mg·L-1,

增殖系数3.95;

1/2MS+NAA

0.1

mg·L-1+活性炭0.1

g·L-1适合诱导生根,

45

d后可获得健壮植株,

生根率100%,

平均根数4.41。将生长良好的植株移栽到等体积

比蛭石、沙子、泥炭土混合的基质中,

成活率66.67%。42

实验方法2.1

种子灭菌和无菌苗的获得2.2

丛芽的诱导2.3

丛芽继代与增殖：以MS为基本培养基,

采用L9

(3

)

正交表设计研究6-BA、NAA和IBA对猴耳环继代增殖

培养的影响。培养45

d后统计诱导率、增殖系数和

平均芽高,

并观察丛芽生长情况。2.4

生根培养2.5

炼苗移栽正交试验设计不同植物生长物质配比对猴耳环丛芽继代增殖的影响：根

据R值的分析结果可知,

对增殖系数的影响6-BA>NAA>IBA,

其中6-BA对增殖系数具有显著性影响,

而NAA和IBA为不显

著因素。比较K值可得,

最优组合为编号9

(MS+6-BA

0.7

mg·L-1+NAA

0.15

mg·L-1+IBA

0.2)草莓、甜樱桃的快繁与脱毒（沈阳农业大学）•

病毒病危害果实品质。•

草莓微茎尖分化成芽•

流程：茎尖培养、增殖继代、生根、驯化移栽、

包装马铃薯试管种快繁（二）组织培养－－倍性育种

花药培养•

通过花药培养，使花粉启动分裂并再生成植株，

再经过加倍获得纯合二倍体，为育种研究提供

宝贵的材料，直接获得优良的品种。•

我国在四季橘、葡萄、苹果等获得花药培养再

生植株。对柑橘花药培养的研究发现，一些长

期有性繁殖的种类，如枳壳，其花药在MT基本

培养基中就可再生。（三）胚抢救将发育不成熟的胚胎在人工培养基上培养，

使其完成发育过程再生成植株。应用：桃等核果类的早熟品种常遇到胚发育不完全的现象。

许多柑橘品种杂交之后，因珠心胚干扰使得杂种胚

发育不良或早夭。由遗传因素引起的胚败育，如远缘杂交无核葡萄品种作母本杂交时常遇到胚败育问题研究成果：•

30年代我国银杏的胚离体培养，•

1974年北京市农林科学研究院将早生水蜜桃×橘

早生的杂种幼胚培养，获得了桃京早3号；•

1975年中国农科院柑橘研究所进行柑橘胚分离培

养，已获得杂种苗。•

意大利Starrantino等人利用二倍体作母本，与四

倍体杂交，通过胚胎抢救技术成功地获得了三倍

体柑橘植株，其中有具商业价值的品系。2.2

原生质体培养、再生、融合技术•

原生质体（Protoplast)：是指去除细胞壁的

被原生质膜包围的“裸露细胞”，是进行基础

研究和品种改良的理想材料。容易接受外来因

素如化学诱变剂等的刺激，并可以摄取外源遗

传物质，如DNA分子、质粒等。•

原生质体培养的再生过程：原生质体分离－纯

化－培养－再生胚状体（或茎芽）－萌发（或

生根）成株园艺植物原生质体培养的成就

1975年柑橘原生质体培养成功现有苹果、梨、樱桃、猕猴桃、柿、枇杷、

草莓、西番莲等木本植物中柑橘最为成功马铃薯、番茄、矮牵牛等原生质体培养已获

成功原生质体融合及杂种细胞培养成株的步骤•

原生质体的融合方法：物理的－－电融合法；化学的

－－PEG（聚乙二醇）诱导法，或PEG和高钙高pH法•

杂种细胞的选择：半选择体系，即一方亲本的原生质

体无分裂能力（叶