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四、实验步骤1连接：pMD18-T载体（Takara试剂盒）pMD18-T

Vector

1ulDNA4ulSolutionI5ul10ul加样16℃30min2转化:

全量(10ul)加入50ul感受态细胞中，冰上放置30min42℃90秒，冰上放置2min加入400ulLB培养基，37℃震荡培养60min3培养鉴定:

10000转，离心2min，取200ul上清丢弃，其余混匀。取50ul涂板（IPTG,X-Gal,氨苄），37℃10-15小时观察，白色菌斑为重组型。实验十目的基因的克隆与鉴定实验十、目的基因的克隆与鉴定一、实验目的掌握目的基因片段连接、质粒转化、菌落培养鉴定方法。为基因测序和其它研究和应用准备高质量的基因片段。连接:回收目的基因片段同克隆载体连接转化:将重组载体导入细菌筛选:通过抗性基因和显色反应选择重组载体回收:在细菌中大量繁殖重组载体并回收鉴定:菌落和重组载体是否含目的基因片段实验流程二、实验原理1、连接Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A；T载体是一种带有3’T突出端的载体；在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。

高效克隆PCR产物（TACloning）的专用载体2、转化细胞经过一些特殊方法如电击法,化学试剂法（CaCl2)等的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。3、鉴定--

α-互补质粒载体带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能。宿主细胞存在可编码β-半乳糖苷酶C端部分的序列。它们同时存在时，能恢复lacZ酶的活性，称为α-互补。在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。三、实验材料1连接：

基因：菠菜actin基因的部分序列（纯化的PCR产物）

载体：pMD18-T载体。（Takara试剂盒）2转化

重组质粒（上步结果）

感受态细胞DH5α（天根生物）

液体SOC培养基（或LB培养基）3鉴定LB固体培养基（IPTG,X-Gal,氨苄）

四、实验步骤1连接：pMD18-T载体（Takara试剂盒）pMD18-T

Vector

1ulDNA4ulSolutionI5ul10ul加样16℃30min2转化:

全量(10ul)加入50ul感受态细胞中，冰上放置30min42℃90秒，冰上放置2min加入400ulLB培养基，37℃震荡培养60min3培养鉴定:

10000转，离心2min，取200ul上清丢弃，其余混匀。取50ul涂板（IPTG,X-Gal,氨苄），37℃

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