血凝时间与凝血酶时间的相关性研究

血凝时间与凝血酶时间的相关性研究

经典的凝血理论认为，凝血过程有两种方式。以往认为内在途径的启动环节——接触激活系统并不参与体内凝血过程。目前较为盛行的凝血学说是两阶段学说,即组织因子途径(外在途径)负责凝血过程的启动,截短的内在途径负责凝血过程的放大。在凝血瀑布形成过程中,凝血酶正反馈作用是关键因素,而其中一个重要反馈点XI因子是两条途径的衔接点。激活部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)均为临床上检测经典内、外凝血途径的常用试验。为寻求一个试验同时反映凝血过程的两个阶段的方法,近年我们已利用玉米胰蛋白酶抑制物(CTI)抑制凝血因子XIIa(FXIIa),证明用稀释的凝血活酶时间可反映两阶段凝血过程。但是,对影响FXIIa受抑稀释凝血活酶时间(FXIIai-DTT)试验各种因素及其临床意义尚不清楚。本研究旨在了解各种抗凝剂、各种制备血浆和某些影响纤溶过程药物对试验的影响,并观察FXIIai-DTT与PT、APTT的相关性。材料和方法1.cti、抑肽酶和羧基苄胺乏因子VIII血浆、APTT试剂盒、兔脑凝血活酶(中国医学科学院血液研究所),CTI(美国EnzymeResearchLab),抑肽酶(北京东亚免疫技术研究所),对羧基苄胺(湖南洞庭制药厂)。2.不同抗凝剂治疗ppp的制备(1)所有试验均用一次性塑料注射器抽取空腹静脉血液。按9份体积全血与1份体积0.13mol/L枸橼酸三钠比例混匀抗凝,3500r/min离心20min,吸取上层液即贫血小板血浆(PPP),用1.5mlEppendorf管分装,即用或冻存于-70℃冰箱备用。(2)正常血浆:在30份静脉血(本院健康学生和教师提供)0.13mol/L枸橼酸三钠抗凝、离心,提取PPP,即成正常单个血浆。取等同正常单个血浆进行混合,即成正常混合血浆。(3)储存血浆和硫酸钡吸附血浆:按参考文献制成。(4)不同抗凝剂制备血浆:另抽5名健康成人静脉血,每份血分别等同注入含0.13mol/L枸橼酸三钠,0.1mol/L草酸钠,1%EDTA-Na2溶液和20U/ml肝素;4支试管中抗凝剂与静脉血体积比为1∶9,混匀抗凝、离心,提取PPP,每种均为5份。(5)患者血浆:血浆标本33份取自湘雅医院住院患者,其中急性心肌梗死(AMI)经冠脉造影确诊的18份,急性缺血性脑卒中(AIS)经CT扫描确诊的15份。血标本均在发病24h内采取,抗凝为0.13mol/L枸橼酸三钠,血浆制备方法与正常血浆相同。3.凝血活酶pt(1)APTT:按厂家试剂盒附说明书操作。(2)PT:按参考文献进行。(3)FXIIai-DTT:同PT测定。但凝血活酶浓度仅为正常血浆PT试验1‰,即1∶1000倍稀释。试验前先向待测血浆中加入CTI(终浓度为25μ/ml)以抑制FXIIa活性。4.数据处理因素组间比较血浆凝固时间数据用ˉx±sx¯±s表示,不同处理因素组间比较采用方差分析,若F>0.05,则以q检验进行两两比较。对FXIIai-DTT与PT、APTT间的关系进行相关分析。结果1.i-dtt、pt、aptt的s30份健康成人枸橼酸三钠抗凝所提取的PPP,分别测定PT、APTT和FXIIai-DTT凝固时间。FXIIai-DTT(81.3±8.9)s,PT(12.9±1.7)s,APTT(37.1±3.5)s。FXIIai-DTT与PT、APTT间的相关系数分别为0.83和0.87(均P<0.01)。说明在不同个体间无论是PT还是APTT的变化,均可相应出现FXIIai-DTT变化,即FXIIai-DTT的长短可反映PT、APTT的长短。2.u3000酸钠凝固时间5份健康人血采用不同抗凝剂提取PPP血浆,所测的FXIIai-DTT、PT和APTT见表1。结果表明4种抗凝剂对3项检测指标产生的影响均不相同。2U/ml肝素对血浆凝固影响作用最强,无论对PT还是对APTT和FXIIai-DTT,其凝固时间均明显长于其他3种抗凝剂,1%EDTA-Na2影响强度次之;0.1mol/L草酸钠影响又较0.13mol/L枸橼酸三钠的时间明显延长。但除0.1mol/L草酸钠和0.13mol/L枸橼酸三钠抗凝血的PT差异不明显(P>0.05)外,3种抗凝剂所测得的其余指标差异均有显著意义(均P<0.01)。从临床实用性考虑,0.13mol/L枸橼酸三钠作为抗凝剂较为合适。3.不同阻凝剂含量的血浆中凝血因子的检测结果正常混合血浆按不同体积比例分别与硫酸钡吸附血浆、储存血浆和乏FVIII血浆混合,测得FXIIai-DTT与PT、APTT的结果(表2)显示,随着3种不同凝血因子缺乏血浆比例含量的增大,血浆中凝血因子随之减少,血浆凝固所需时间延长。但3种不同乏凝血因子血浆的检测结果则不相同,其中PT延长以硫酸钡吸附血浆影响最为显著,储存血浆次之,乏FVIII血浆几乎无影响;而APTT则均呈剂量关系延长。无论PT还是APTT延长,或者两者都延长时,可发现FXIIai-DTT也延长。说明血浆中凝血因子含量的减少,可在FXIIai-DTT试验中得以反映。此外本试验结果显示,当储存血浆和乏FVIII血浆比例在20%或以下时,其血浆凝固时间可正常,证明正常血浆中凝血因子有足够的生理贮备。4.羧基苄胺化合物类化合物pge对pge-tt、pt和aptt变化在枸橼酸三钠制备的混合血浆中分别加入抑肽酶(终浓度为200U/ml)和对羧基苄胺(终浓度为0.1g/ml),测定FXIIai-DTT、PT和APTT变化,结果(表3)显示,抑肽酶和对羧基苄胺对PT、APTT影响不明显(P>0.05),但使FXIIai-DTT延长(P<0.01)。5.凝固时间相关指标18份AMI和15份AIS患者血浆3项指标结果(表4)显示,AMI和AIS患者血浆凝固时间较混合血浆加快,表现为FXIIai-DTT、PT及APTT均缩短,其相关性具有显著性差异(均P<0.05)。说明其血浆中凝血因子的活性或含量比正常混合血浆高。重新设计凝血因子浆凝血过程,见表1临床上以APTT和PT分别检测内、外途径凝血过程中凝血因子含量及功能变化,但并不能反映体内生理凝血全过程。临床和试验均表明,接触系统(由高分子量激肽原、前激肽释放酶与XII因子组成)蛋白缺乏或缺陷在体内并不引起出血表现,相反这3个蛋白的纯合子缺乏患者存在血栓倾向。APTT试验中,加入外源性带负电荷的硅藻土或白陶土,可通过接触系统活化而致系列凝血因子的激活,产生血浆凝固,临床常以该试验时间延长判断FVIII、FIX和FXI缺乏或严重的功能障碍。PT试验则以加入大量的组织因子(不同来源的凝血活酶)而致外在途径的凝血因子激活,产生血浆凝固。实际上,在生理情况下,血管壁损伤引起少量组织因子激活即可启动凝血过程,已证明生理凝血是通过凝血酶正反馈活动进行的。即起始的微量凝血酶除可激活血小板外,还可激活FXI、FVIII、FV等,通过内在途径维持放大凝血过程,使凝血酶足量生成而导致血液凝固。近来的资料证实,凝血酶对FXI的激活具有重要意义。FXIIai-DTT试验即以此为依据而设计,它不仅反映了低浓度组织因子对外在途径的启动,而且反映微量凝血酶通过“截短”的内在途径(由FXI起始)的放大,因此该试验可反映参与两条经典凝血途径的凝血因子的功能状态。我们曾报道FXIIai-DTT试验能够反映凝血过程的两阶段变化。本研究不但进一步支持FXIIai-DTT试验的结论,而且FXIIai-DTT与PT和APTT间存在着一定的正相关关系(r=0.83,P<0.01)。此外,不同个体间3项指标值有差异,而同一个体的血样本在不同时间所测得的值也不同,但是FXIIai-DTT的变化则与APTT、PT变化相一致。由于在体外FV和FVIII的稳定性差,易失活,要求APTT血浆标本必须在4h内检测。因此进行FXIIai-DTT也应尽快在短时间内完成。4种抗凝剂制备血浆所测得FXIIai-DTT均延长且明显不同。枸橼酸三钠、草酸钠和EDTA均是Ca2+的络合剂,其中EDTA可与Ca2+形成一种不溶性复合物,具有强的Ca2+络合能力。除此之外,EDTA还具有灭活FV的作用,因而血浆凝固时间较草酸钠和枸橼酸钠要长。而草酸钠结合Ca2+的能力较EDTA弱,但较枸橼酸三钠强,因此枸橼酸钠制备血浆的凝固时间最短。凝血酶是参与凝血后期反应的关键酶,肝素通过与抗凝血酶Ⅲ结合,可抑制凝血酶和丝氨酸蛋白酶(FXa、FIXa、FXIa)及血小板活化功能,而致血浆凝固时间明显延长(本试验为10min内不凝固)。从4种抗凝剂所得的结果说明FXIIai-DTT可反映血浆中凝血抑制物的状态。缺乏不同的凝血因子血浆FXIIai-DTT延长,也证明FXIIai-DTT是一种具有反映凝血因子含量或功能状态的试验方法。在乏FVIII血浆中,随着其缺乏比例增高,APTT和FXIIai-DTT也相应地延长。因此认为FXIIai-DTT与APTT一样,也可作为检测血友病的一种试验方法应用于临床。在用硫酸钡吸附血浆中FII、FVII、FIX和FX后,由于主要的外在和共同凝血途径受到影响,因而FXIIai-DTT与PT均延长的相关性更为密切,FXIIai-DTT可反映出外凝血途径受影响。在储存血浆中,由于血浆贮存时间过长导致血浆中FV和FVIII的失活,FXIIai-DTT延长与APTT的相关性更大,因为贮存血浆缺乏内源性凝血途径的凝血因子FVIII和共同途径中的FV,说明FXIIai-DTT的变化也可反映内在凝血途径的变化。但需要强调的是,血浆中的凝血因子浓度或活性需要低到一定程度时,FXIIai-DTT才会与APTT和PT一样出现变化。这是因为正常血浆凝固并非全部凝血因子参与,即正常生理情况下,血浆中的凝血因子有较多的贮备,因此在一定范围内随着血浆的稀释,某些检测凝血因子的试验会表现“正常”。有关抑肽酶和对羧基苄胺致FXIIai-DTT延长,而对PT和APTT无明显影响的现象,其机理尚不清楚,可能与抑肽酶能竞争抑制FVIIa-TF复合物有关。但是纤溶系统与凝血系统存