谷氨酸在戊四唑化学点火癫痫模型中的作用

谷氨酸在戊四唑化学点火癫痫模型中的作用

癫痫是一种常见的慢性临床综合征，其发病机制非常复杂。目前,多数学者认为,是兴奋性神经递质和抑制性神经递质平衡失调所致。谷氨酸(Glutamate,Glu)是中枢神经系统主要的兴奋性氨基酸神经递质,其含量的增多起着决定性的作用。但其含量是如何增加,以及增加以后是怎样引起癫痫发作的机制仍然不是很清楚。因此,本实验在采用戊四唑化学点燃模型的基础上,按不同发作级别,通过免疫组织化学方法和图象分析技术,来观察癫痫模型大鼠脑内Glu表达的动态变化,旨在进一步揭示其在癫痫发病中的作用。1材料和方法1.1亚惊厥racine评分健康成年雄性Wistar大鼠30只,体重200~220g,实验前在安静环境下饲养24h以上。随机分为2组:对照组6只和模型组24只。模型组按点燃不同进程又分为4组:Ⅰ级发作组(Ⅰ级组)、Ⅲ级发作组(Ⅲ级组)、Ⅴ级发作组(Ⅴ级组)和Ⅴ级发作后间歇24h组(Ⅴ级/24h组),每组各6只。各组大鼠分别于癫痫发作I级、Ⅲ级、V级和V级后24h灌注取材。安静室内,将大鼠放在有机塑料箱内(20cm×50cm×20cm)。每隔日腹腔注射一次阈下剂量的戊四唑35mg/kg(pentylenetetrazol,PTZSigma公司产品)即亚惊厥剂量。每48h一次,连续给药13次,每次观察1h。每次注射均在早上8:00~10:00进行,同时观察大鼠行为变化。行为惊厥评分采用Racine评分法,即0级:未发作;Ⅰ级:头面部抽搐;Ⅱ级:肌阵挛、跳起,但无直立;Ⅲ级:肌阵挛,双前肢抬起伴有直立;Ⅳ级:强直-阵挛性惊厥;Ⅴ级:全身强直-阵挛性惊厥伴有翻滚、跌倒。凡获连续至少3次Ⅳ或Ⅴ级发作的大鼠,被认为是完全点燃。1.2glu免疫反应阳性神经元的检测取实验大鼠脑组织,常规石蜡包埋,Leitz切片机切片,片厚5μm,行免疫组织化学染色。实验步骤如下:组织切片经二甲苯脱蜡,梯度酒精下行,并水化到0.01mol/LPBS缓冲液中;微波炉抗原修复15min;0.3%TritonX-10030℃孵育30min;滴加A液过氧化酶阻断剂,30℃孵育10min;滴加B液,30℃孵育10min,0.01MPBS(pH7.4)浸润;滴加一抗(兔抗Glu多克隆抗体,美国Sigma公司<日本刘继光博士惠赠>),4℃冰箱内孵育48h;滴加C液,30℃孵育30min;滴加D液,30℃孵育30min;DAB呈色反应,在光镜下控制显色3~5min;上述各步骤间均采用PBS充分洗涤。梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。替代实验,用PBS代替一抗,余同。未见Glu免疫表达阳性。参照PaxinosandWatson所著的大鼠脑立体定位图谱,在Olympus显微镜下,将Glu免疫组织化学染色切片与相邻的Nissl染色切片比较进行定位,观察大鼠海马结构齿状回(DG)和海马回CA3区及大脑颞叶皮质(TC)内Glu免疫反应阳性神经元的形态及其分布。每例取6张Glu染色切片,在显微镜下观察,用显微镜目测器对大鼠海马DG、CA3及大脑TC内Glu免疫反应阳性神经元进行数目测定,测量窗面积为16900μm2。每张切片各部位均随机观察3个视野,取其平均值。采用Tiger图象分析仪测定海马DG、CA3和大脑TC的免疫反应阳性神经元的平均光密度(AOD)值,每只大鼠各选6张切片,每张切片的每个测定部位随机选3个视野,取平均值。所有AOD值测量均在相同的光学条件下完成。1.3酒精密度、酒精用量石蜡切片常规脱蜡,梯度酒精,水化;入0.1%焦油紫37℃10min;蒸馏水洗;70%酒精、95%酒精、100%酒精各3次,每次1min;二甲苯透明,中性树胶封片。结果用SPSS10.0forwindows统计软件进行统计学处理。实验数据采用x¯±sx¯±s表示,作单因素方差分析,进行组间的两两比较,以α=0.05为显著性水准,判断各组之间的差异是否具统计学意义。2结果2.1肢体肌注及流瞳在PTZ连续注射过程中,大鼠逐渐出现凝视、点头、面部及头部抽搐、全身肌阵挛、双前肢抬起、最终发生全身性强直-阵挛性发作伴有跌倒及流涎。PTZ完全点燃的大鼠,有自始自终的发作过程,其惊厥等级分明,全身强直-阵挛性惊厥十分明显。2.2glu-ir阳性大鼠脑区免疫反应镜下可见,对照组大鼠Glu免疫反应(Glu-IR)阳性神经元主要分布在DG的颗粒细胞层和海马回的锥体细胞层及大脑皮质各层。阳性细胞的胞浆呈均匀棕黄色,胞核未着色。模型组大鼠各部位的Glu-IR阳性较对照组大鼠相应脑区的免疫反应阳性增强,细胞数目增加,排列紧密,形态多以圆形和椭圆形为主(图1、图2和图3)。戊四唑点燃癫痫大鼠,Ⅲ级组和Ⅴ级组与对照组相比,DG、CA3和TC的Glu-IR阳性神经元数目和AOD值显著性增加(P<0.05或P<0.01);Ⅴ级组与Ⅲ级组相比,相应部位Glu-IR阳性神经元数目减少和AOD值下降,差别有统计学意义(P<0.05);I级组和Ⅴ级/24h组与对照组相比,相应部位Glu-IR阳性神经元数目和AOD值差别无显著性(P>0.05,表1、表2)。3讨论3.1戊四唑化学点燃模型点燃目前被公认为是一种理想的癫痫动物模型,其致痫性增高具有永久的保留能力,并较好地模拟了人类癫痫的进行性发展和长期反复的自限性发作形式。戊四唑是一种常用的化学致痫剂,本实验采用的戊四唑化学点燃模型是一种全身发作性癫痫模型,较成功地复制出了接近人类癫痫的慢性癫痫模型。此模型具有以下优点:①制作方便,成功率高;②不受麻醉剂和手术过程的影响,便于全面观察动物惊厥发作;③所需仪器设备简单,容易推广;④不破坏局部脑组织的结构,不伴有神经元损伤、坏死,有利于进一步开展脑组织各项指标的检测,尤其适用于癫痫脑组织形态学的观察。3.2glu在癫痫发病过程中的作用Glu作为脑内的一种兴奋性氨基酸神经递质,其兴奋性增强在癫痫的发生发展中起着重要作用。其含量的增加、代谢的变化、受体密度的增加及结合位点的增多等都可以引起其作为一种神经递质兴奋性的变化。其中其含量的增加是一种始动因素。本实验的研究结果发现,戊四唑点燃癫痫大鼠,Ⅲ级组和Ⅴ级组与对照组相比,海马DG、CA3区谷氨酸免疫反应阳性神经元数目和AOD值均有明显增加。与以往的实验结果相符,并以不同的癫痫模型进一步验证了Glu在癫痫发病中起作用。同时,本实验对戊四唑化学点燃进程中Glu的含量变化作一动态观察,发现点燃过程中,随着点燃的发展,Glu的含量变化是呈先增加后减少的趋势。其中Ⅲ级发作组,Glu-IR阳性神经元数目和AOD值最高,Ⅴ级发作组(完全点燃组)有所下降。Ⅴ级/24h组,基本恢复到对照组水平。有文献报道,在海马双侧缓慢置入普通电极和微透析电级,脑电图观察发现癫痫发作产生前在发作侧局部病灶就有胞外Glu显著增高。体外微透析测定也发现,癫痫发作引起谷氨酸释放加倍,而清除减少。胞外谷氨酸的释放增加与癫痫发作密切相关。因此,本人推测可能正是由于在完全点燃时,细胞内Glu大量释放,细胞外Glu含量相应增加,细胞内Glu含量则由于大量释放而减少,而当细胞内含量减少到一定程度时,Glu阳性细胞则转为阴性,从而会出现Ⅴ级发作组Glu