小麦条锈病抗性的超微结构研究

小麦条锈病抗性的超微结构研究

国内外广泛实践证明，利用品种抗病性防治小麦锈病是最经济有效的措施之一。进行麦类锈菌与其寄主互作关系的研究,可阐明寄主植物的抗锈机制及病菌的致病机理,从而为抗锈品种的选育与合理利用提供科学依据,并为抗锈生理生化、分子生物学研究奠定基础。这一研究领域涉及遗传学、组织学、细胞学、生物化学和分子生物学等学科,而互作关系中组织学和超微结构则是该研究领域的一个重要组成部分。在小麦的3种锈病中,国外学者已从组织学和细胞学方面对秆锈菌、叶锈菌与小麦的互作关系开展了系统深入的研究,然而,小麦条锈病未受到应有的重视。近年来,笔者利用生物电镜技术就小麦与条锈菌的亲和组合和非亲和组合的细胞学特征进行了系统研究,发现小麦条锈菌的一些主要超微结构特征明显不同于其它2种小麦锈菌。并对小麦条锈菌在亲和组合中的侵染及寄主反应的细胞学时间顺序进行了报道。笔者又以低反应型抗性小麦为试材,报道非亲和组合中小麦与条锈菌相互关系的组织学和细胞学特征。1材料和方法1.1种cy29、323供试小麦品种天选882、牛朱特、杂种46、辉县红,小麦条锈菌条中28号小种(CY28)、29号小种(CY29)由西北农林科技大学植物病理研究所提供。天选882小麦品种与CY29组成免疫组合;小麦品种杂种46和牛朱特分别与条中CY29、CY28构成近免疫组合;辉县红与CY28构成感病对照组合。1.2麦条锈菌的繁殖小麦幼苗材料按康振生等介绍的方法在植物生长箱中培养,当小麦第一叶展平时,即用于接种试验。小麦条锈菌菌种按常规方法在感病小麦品种辉县红上繁殖。接种时,将新收取的病菌夏孢子与滑石粉混合,用毛笔蘸取并均匀地轻涂于叶表,经喷雾、保湿24h后,接种幼苗继续在生长箱中培养。根据试验观察需要,分别于接种后24、36、48、72、96、120h取样,用于不同的染色处理。1.3荧光显微镜观察将接种小麦叶片切成2cm长叶段,按康振生等介绍的荧光染色法(染色剂为CalcoflourWhite)处理后制片,然后用OlympusH2-F荧光显微镜和OlympusBH-2微分干涉显微镜观察、测定和记载。每处理随机检查30个侵染点,统计观测指标包括菌丝长度、菌丝分枝数,吸器母细胞数及寄主细胞坏死情况。1.4微生物的干涉接种小麦叶片的整叶透明处理按魏国荣等介绍的方法进行,叶段于甲醇-氯仿液中处理6h后,在乳酚油-乙醇液中煮沸1.5min,放置过夜后,转至饱和水合氯醛中,3d后在微分干涉显微镜下观察。每处理随机检查30个侵染点,观测统计吸器数目。1.5叶片的预处理接种小麦叶片透射电镜样品的加工处理按康振生介绍的方法进行。将叶片切成小块,经3%戊二醛和1%锇酸双固定,用系列丙酮脱水、Epon812树胶包埋。样品超薄切片经醋酸铀和柠檬酸铅染色后,于Philips420型透射电镜观察。2结果与分析2.1叶片组织型感病品种辉县红接种CY28后呈典型的4型反应,夏孢子堆大而多,破裂呈粉状,周围组织无枯死反应,早期无失绿现象,属高度感病型;杂种46接种CY29、牛朱特接种CY28后呈0;型反应,即近免疫反应型,叶片呈失绿、枯死斑反应,无夏孢子堆产生;天选882接种CY29后不产生任何可见症状,叶色正常,为0型反应,属免疫型。2.2气孔红气湿性测定条锈菌夏孢子在小麦叶表萌发后产生芽管,芽管经扩展而由气孔伸入叶组织内,并相应产生初生菌丝、初生吸器母细胞、初生吸器及次生菌丝和吸器。在小麦品种与条锈菌的不同组合中,病菌的生长发育及寄主的反应表现出明显的差异。2.2.1近免疫组合检测菌落生长规律接种后48h内,不同抗性组合中的病菌均以初生菌丝形态存在,未形成典型的分支,菌丝线性生长与感病对照相似。接种后48h观察,只有感病对照产生次生菌丝,其线性长度大于其它抗性组合。近免疫组合在接种后96h病菌出现简单分支,免疫组合则在整个采样过程中一直未产生次生菌丝、无菌落形成。与之相对应,菌落的线性长度与分支数变化规律相似,在接种后48h内,各组合间菌落线性长度几乎没有差异,从接种后48h开始,完全免疫组合和近免疫组合中菌落扩展非常缓慢。到接种后96h,近免疫组合和免疫组合菌落线性长度都远远小于感病对照,而免疫组合的菌落线性长度也小于近免疫组合(表1)。2.2.2近免疫组合中吸器母细胞和吸器的变化接种后24h所有组合中病菌都产生了初生吸器母细胞和初生吸器,每侵染点吸器母细胞和吸器数目在接种后48h内增加缓慢,各组合间差异很小。近免疫组合中从接种后48h开始吸器母细胞和吸器形成明显受抑,到接种后96h,吸器母细胞和吸器的数量仅有感病对照的9%～11%。免疫组合从接种后48h开始吸器母细胞和吸器的数目明显少于感病对照,同时也少于相应的近免疫组合,在整个采样期几乎无明显增长(表2)。2.2.3肝胰腺组织病理变化寄主细胞坏死是不同抗性组合接种后所表现出的一种普遍现象(表3)。接种后24h就可观察到散生于侵染点周围坏死的叶肉细胞,而且免疫组合中含坏死叶肉细胞的侵染点比率明显高于近免疫组合。近免疫组合中,叶肉细胞坏死面积大,发生频率及程度高;侵染点周围,与侵染菌丝接触或不接触的寄主叶肉细胞均可大面积坏死,病菌的侵染结构常常被包围在其中。完全免疫组合中寄主叶肉坏死面积并不大,多数坏死细胞为初生吸器母细胞所接触或入侵的细胞,少数为邻近未受侵染的细胞。观察发现条锈菌菌丝生长受抑与寄主细胞坏死密切相关,菌落线性生长受抑与寄主细胞坏死同步发生或寄主坏死后12h发生。在不同抗性组合中,含坏死细胞的菌落平均线性长度明显小于无坏死细胞的菌落,这表明寄主细胞坏死对抑制病原菌的生长有重要作用。2.3病原菌胞间细菌感染级电镜观察发现在抗病品种上病菌不仅生长发育受抑,而且病菌的胞间菌丝、吸器母细胞、吸器在形态和结构上也发生了一系列的变化,同时寄主细胞也产生了相应的结构防卫反应。2.3.1由细菌细胞膜转化为细胞细胞器在接种初期(接种后48h),胞间菌丝的形态基本正常,但菌丝细胞原生质的电子致密度加深,液泡增多,同时出现大量泡状物(图版Ⅰ-1～4)。随后菌丝内液泡增大,泡状物与菌丝细胞质膜融和而沉积到菌丝壁上,使得菌丝细胞壁加厚,同时菌丝细胞质开始紊乱,线粒体肿胀,菌丝质膜和细胞核膜染色加深,细胞器部分解体。到寄主症状明显时(接种后4～5d),菌丝细胞坏死畸形(图版Ⅱ-1～3),细胞质完全解体或凝聚变黑,菌丝细胞壁不规则增厚,并且发现大量电子致密度的物质从菌丝细胞渗出。2.3.2吸器母细胞的发育吸器母细胞通常位于胞间菌丝的顶端,其主要功能是产生入侵栓、穿越寄主细胞壁而在寄主细胞内形成吸器(图版Ⅰ-2)。电镜观察发现,吸器母细胞的发育在不同抗性组合中存在两种类型:一部分吸器母细胞的形态结构正常,可侵入寄主细胞并产生吸器(图版Ⅱ-4);而另一部分吸器母细胞的发育明显受抑,吸器母细胞的原生质和细胞器发生了类似于以上胞间菌丝细胞的不正常变化,而最终变为畸形(图版Ⅱ-5),丧失产生入侵栓结构和吸器的能力。2.3.3吸器受抑类型吸器是锈菌形成于寄主细胞内的惟一结构,其主要功能是从寄主细胞内吸取发育所需的营养物质。电镜观察发现,在感病品种上成熟的小麦条锈菌吸器由呈管状的吸器颈部和呈球形的吸器体组成。在不同抗性组合上,小麦条锈菌病菌所形成的吸器形态异常、发育受抑。根据吸器发育受抑的程度和吸器畸形的特点,可将吸器受抑的类型分为两类。第一类为吸器发育早期受抑型,吸器体一般不能正常膨大,仅产生一些不规则的分枝而呈畸形(图版Ⅲ-1);第二类为吸器发育后期受抑,初形成的吸器其形态和结构正常,但随进一步发育,吸器内出现一系列的异常变化,其中包括吸器质膜与细胞核质膜电子致密度加深、原生质内液泡增多且逐渐增大、线粒体肿大破裂、吸器外间质不规则加宽并出现致密度深的物质,吸器最终坏死而变成畸形(图版Ⅲ-2,3)。2.3.4独立的微生物细胞当条锈菌侵染不同抗病品种后,寄主细胞的反应较为复杂,其抗病反应主要涉及寄主细胞新的防卫结构的形成和寄主细胞的坏死过程。电镜观察发现,在感病小麦品种上,当条锈菌胞间菌丝在寄主细胞间扩展时,寄主细胞通常无明显反应,其细胞器仍保持正常状态。然而,当病菌在抗病品种上扩展时,寄主细胞通常可产生两种防卫反应结构:第一种是在与菌丝接触的寄主细胞内,细胞壁与质膜间沉积出一层电子致密度高的物质,即胞壁沉积物(图版Ⅲ-4);第二种是在病菌穿过寄主细胞壁处,寄主细胞往往可分泌大量的胼胝质而形成乳突结构,同时寄主细胞可在吸器周围形成大量电子致密度高的物质,将吸器完全包围起来,从而使得吸器体不能正常膨大而呈畸形,并最终坏死(图版Ⅲ-1)。寄主细胞的坏死一般都发生在受侵细胞和侵染点四周的细胞,电镜观察发现在寄主细胞的坏死过程中,寄主细胞的质膜、液泡膜、叶绿体外膜的染色程度首先加深,随后细胞质致密度加深,细胞器排列紊乱、松散,最后细胞质凝集,细胞器解体,整个细胞坏死畸形(图版Ⅲ-5)。同时坏死寄主细胞和坏死菌丝的渗出物往往也可造成相邻寄主细胞的坏死。3．流式抗条锈菌的急性毒性反应小麦对条锈病的低反应型抗性是目前小麦生产中广泛应用的一类抗性。笔者采用荧光显微镜、微分干涉显微镜和电镜技术,较系统地研究了此类抗性的免疫和近免疫组合中病菌和寄主在组织学和超微水平上的一系列变化特征,所获结果有助于对寄主的抗条锈机制有更深入的了解。研究结果表明,小麦条锈菌在感病品种和抗病品种上的发育存在明显的差异。小麦低反应型抗性组织学表现为病菌菌丝生长受抑,菌落形成延迟或败育,病菌吸器母细胞和吸器形成量明显减少;电镜观察揭示出在抗病品种上,病菌的胞间菌丝、吸器细胞和吸器在细胞和细胞亚水平均发生了一系异常变化,其中包括原生质的电子致密度加深,细胞内液泡增多变大,菌丝细胞壁不规则增厚,细胞器排列紊乱及解体,吸器母细胞及吸器丧失其生理功能,病菌最终畸形坏死。同时,笔者还观察到抗病品种被条锈菌侵染后,寄主细胞防卫结构如胞壁沉积物、胼胝质的形成速率及在细胞中的分布范围远远高于受感染的感病品种。病菌生长受抑的这些表现无疑是与寄主抗病性的表达密切相关。小麦条锈菌与小麦非亲和组合的这些组织学和细胞学特点与小麦秆锈病、燕麦冠锈病、谷子锈病及菜豆锈病体系中所报道的结果基本一致。过敏性坏死反应是典型的抗病性机制,绝大多数抗锈基因,特别是低反应型抗锈基因多是通过过敏性坏死反应来发挥作用的。各国学者多根据寄主细胞坏死和锈菌发育受抑的时间顺序来评价寄主坏死的作用。笔者发现,寄主细胞坏死就是低反应型抗条锈性所表现出的一种普遍现象,接种后24h就可以观察到侵染点周围寄主叶肉细胞坏死的现象,并且含坏死细胞的菌落生长的受抑程度明显高于无坏死细胞的菌落,故寄主细胞坏死对抑制病菌的生长具有重要作用,这表明在小麦条锈菌与小麦这一体系中,寄主过敏性坏死反应是小麦抗条锈性的重要机制之一。关于导致过敏性反应的时间顺序在不同的寄主-病菌体系中存在不同的观点。Harder等、Heath曾分别研究了小麦与小麦秆锈菌、菜豆与菜豆锈菌非亲和组合的超微结构,指出寄主的坏死与锈菌吸器的坏死几乎是同时发生;Skipp等、Rohringer等通过小麦抗锈近等基因系与小麦秆锈菌互作的组织学和超微结构研究,认为受侵寄主细胞的坏死往往先于锈菌吸器的坏死。然而,笔者通过对不同抗条锈性组合中的细胞学观察,发现吸器受抑或坏死时,受侵寄主细胞大都基本正常,未观察到吸器正常而寄主细胞坏死的情况,故在小麦与条锈菌非亲和组合中寄主细胞坏死晚于吸器坏死,而吸器的坏死可能是寄主细胞生理或生化代谢影响的结果。Prushy等从定性和定量方面分析了燕麦冠锈菌与寄主间的互作关系,发现寄主细胞的坏死迟于吸器的坏死,这一结果与小麦条锈病的系统相类似。因此,在锈菌与其寄主的互作过程中,就寄主细胞与病菌吸器坏死间的顺序关系因病菌—寄主、及寄主所含抗性基因的不同而存在较大的差异。那么,寄主细胞过敏性坏死反应的分子机制是否存在类似的差异值得进一步探索。植物细胞受病原物侵染时在细胞壁与质膜所沉积形成的胞壁沉积物(cellwallapposition)是植物抵御病菌侵染的重要防卫结构之一。Jacobs在研究慢锈性小麦对叶锈病的组织学抗性机制时发现,受侵小麦细胞形成的胞壁沉积物极为常见,认为胞壁沉积物的形成是小麦抗叶锈病的主要抗性机制之一。笔者观察发现,感病品种被小麦条锈菌侵染后,很难在被侵组织中观察到胞壁沉积物的形成,然而在被侵的低反应抗型的小麦品种上,其被侵组织中形成的胞壁沉积物不仅极普遍,而且其厚度有时远远大于寄主细胞壁,同时坏死的寄主细胞及病菌菌丝的渗出物也可以诱发相邻的寄主细胞形成胞壁沉积物。最近,笔者采用细胞化学和免疫细胞化学方法就胞壁沉积物中的成分进行了定位分析,发现其内含有β-1,3-葡聚糖、纤维素和木质素等物质。抗病小麦品种受条锈菌侵染形成的胞壁沉积物,不仅可加固寄主细胞壁对病菌侵入抗性的物理作用,而且可阻碍病菌分泌的有毒物质向寄主细胞内扩散。因此,胞壁沉积物的形成可被认为是小麦抗条锈性的重要结构防卫反应之一。锈菌吸