细胞生物学技术：细胞生物学新技术简

细胞信号转导研究技术(2)2015.12

His-Cax-+-+HA-p65--++

IP:Anti-HisIB:Anti-HA

Anti-His

Anti-HA

IP:Anti-HAIB:Anti-HisTotalcelllysates1234InVivoBindingAssay

(Co-mmunoprecipitation,CoIP)(免疫共沉淀)proteinA-agarosebeadsHA-p65Anti-His-IgGProteinAHis-Caxagarosebeads有时侯，抗体可以直接偶联到agarosebeads上Anti-HA-IgGHis-CaxHA-p65agarosebeadsMNO现在我们有足够的证据表明，p65是Cax的相互作用蛋白p65是转录因子NF–κB的一个亚基，NF–κB已经得到广泛深入的研究。下一步的研究应该是Cax是否参与调节NF–κB的活性，如何调节？NF-κB的激活

转录因子(transcriptionfactor)在GPCR途径中有CREB酶偶联受体：

RTK-Ras-MAPK途径中有cMyc,cJun,cFos

其他：STAT、Smad在受调蛋白水解依赖的信号转导途径中有NF-κB

在核受体信号途径中,核受体自身为转录因子。

转录因子就是基因调控蛋白，通过与DNA上基因调控序列结合，调节基因转录。在研究某些因素对NF–κB信号系统的影响的时候，分为不同层次：细胞质层次：

IκB激酶的激活（kinaseassay)IκB的降解(Westernblot)细胞核层次：NF–κB与DNA的结合能力（invitro)（EMSA)NF–κB与DNA的结合（invivo)(ChIP)NF–κB与co-activator或co-repressor的关系05101530600510153060min

VectorHis-CaxIκBα(37KD)β-actinCax对IκB降解的影响(Westernblot)制备稳定表达Cax的细胞系：逆转录病毒载体或pcDNA3G418筛选TNFα抗原等蛋白样品经SDS处理后全部带上负电荷，从而使蛋白之间仅有分子大小的差异。将少量待测蛋白样本加入夹在两块玻璃平板之间的聚丙烯酰酰凝胶顶部的加样孔中。组织或细胞的蛋白裂解产物凝胶玻璃平板将凝胶置于电场中，凝胶的底部接正极。带负电荷的蛋白向凝胶底部的正极泳动，并按分子大小的不同形成分离的条带。蛋白分子的泳动速率与分子的大小成反比，最小的多肽最先到达凝胶的底部。凝胶可以用能结合多肽的染液进行染色。最终在凝胶中显示样本中各多肽的位置。BlottingUsedtoidentifyasingleprotein/DNA/RNAmoleculeinacomplexmixturethathasbeenseparatedbygelelectrophoresisProbesarelabeledforeasyvisualizationWhenantibodiesareusedtoprobeforspecificproteinsinagel,thisiscalled“westernblotting”SouthernblottingisprobingforaDNAsequencewithaDNAprobeNorthernblottingisprobingforanRNAsequencewithaDNAprobeAntibodiesProteinsthatplayacriticalroleinhumoralimmunityTocellbiologists,theyare“tools”forresearchHighlyselectiveforspecificmoleculesEasytopurifyEasytochemicallymodifywith“tags”thatcanbevisualizedCansometimesimpactthefunctionofaproteininalivingcell(e.g.,herceptin)Polyclonalantibodies次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）胸腺嘧啶核苷激酶（TK）次黄嘌呤（hypoxanthine,H）氨甲喋呤（aminopterin,A）胸腺嘧啶核苷（thymidine,T）氨甲喋呤是叶酸的拮抗剂DAPIHis-Cax

Anti-His免疫荧光：p65可能位于细胞核或细胞质，那么Cax定位于哪里呢？亚细胞定位带标签的重组蛋白重组蛋白His-tagHA-tag共定位重组DNA技术ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＴＴＡＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＸＹＡＴＧCax与p65的细胞核共定位:TNFalpha处理2小时

Anti-p65

Anti-PML

Anti-Cax

Anti-Cax

Merge

MergeP65与Cax共定位于细胞核内对NF-kB的功能有何影响？

转录因子受到co-activator或co-repressor的调节，可以引起染色体重构，从而改变核小体的局部构象，使得转录复合体易于或不易于接近转录起始点。?Cax很可能是NF–κB的共激活因子（co-activator)或共抑制因子(co-repressor)用报告基因来检测转录因子的活化：绿色荧光蛋白2.半乳糖苷酶

3.荧光素酶(Luciferase)TitrationHis-CaxJ16Cax抑制NF–κB的转录活性5’-deletionanalysiscanidentifytranscription-controlsequencesinDNAupstreamofageneIFN-

、IFN-

可诱导胚胎成纤维细胞CAX的表达RT-PCR结果1000U/mlIFN-

M--+/+c6h12h24h-/-cG3PDHmCAXNorthern100U/mlIFN-

C6h12h24hC6h12h24hG3PDHmCAX+/+-/-Anelectrophoreticmobilityshiftassay(EMSA),alsoreferredasagelshiftassay,gelmobilityshiftassay,isacommontechniqueusedtostudyprotein-DNAorprotein-RNAinteractions.ThisprocedurecandetermineifaproteinormixtureofproteinsiscapableofbindingtoagivenDNAorRNAsequence,andcansometimesindicateifmorethanoneproteinmoleculeisinvolvedinthebindingcomplex.

p65NFκBbindingsites凝胶电泳迁移率变迁分析（Electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA）

，也称GelShift。检测转录因子与DNA结合的能力（invitro)：检测转录因子与DNA结合的能力（invitro)：凝胶电泳迁移率变迁分析（Electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA）

，也称GelShift。TNFα-+-+

NF-κBFreeprobeVectorHis-CaxCax不影响NFκB与DNA结合的能力（DNAbindingcapacity）核蛋白粗提物32P标记NF-κB探针1与2孵育,SDS,放射自显影检测转录因子与DNA结合的能力（invitro)：凝胶电泳迁移率变迁分析（Electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA）

，也称GelShift。

凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA）是目前研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用方法，但是由于许多转录调控蛋白有相似或相同的DNA结合位点，这种体外分析获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和DNA结合的状况。染色质免疫沉淀分析（ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。染色质免疫沉淀技术（chromatinimmunoprecipitationassay,CHIP）

研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。该技术主要应用：1.组蛋白修饰研究2.转录调控分析3.药物开发研究4.有丝分裂研究5.DNA损失与凋亡分析。下图是ChIP技术的作用原理。=p65IntactcellCrosslinkwithformaldehydeHarvestcellsSonicatetofragmentchromatinReversecrosslinkingbyheatingat65°CovernightanduseRNAseandproteinaseKtodegradeproteinandRNACheckfragmentationbyrunninganagarosegelDividechromatininto3aliquots:(1)input,(2)IPwithIgG,(3)IPwithp65antibodyPerformIP活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物将其随机切断免疫学方法沉淀Reversecrosslinkingbyheatingat65°CovernightUseRNAseandproteinaseKtodegradeproteinandRNAPurifyDNAandrunPCRontargetsequences(cyclinD)RunSDStocheckifproteinwasprecipitatedbytheantibodyspecificallyinputIgGp65IgGp65inputIgGp65Positiveprimer检测转录因子与DNA结合（invivo)：染色体免疫沉淀（chromotinimmunoprecipitation,ChIP）

InputAntip65

His-Cax

cyclinD1promoter

cyclinD1promoter

VectorIgGCax不影响NFκB与DNA的结合（DNAbinding）Anti-p65-IgGp65NFκBbindingsites

cyclinD1promoterChromotinprocessingtosmallfragments(500-600bp)Anti-p65immunoprecipitationPCRforcyclinD1promoter(containingNFκBbindingsites)细胞质层次：

IκB激酶的激活（kinaseassay)IκB的降解(Westernblot)细胞核层次：NF–κB与DNA的结合能力（invitro)（EMSA)NF–κB与DNA的结合（invivo)(ChIP)Cax对NF–κB信号系统的影响作用环节可能在co-repressor

共激活因子（co-activator)或共抑制因子(co-repressor)往往就是通过调节组蛋白的翻译后修饰实现其功能的组蛋白可以有多种翻译后修饰形式：

磷酸化乙酰化泛素化甲基化这些修饰会影响组蛋白的构象，从而影响转录复合体与DNA的结合：Histonecode引起染色体重构(Remodeling)的因子：ATP-dependantRemodelingComplexesHATorHDACComplexesHAT:histoneacetyltransferase（组蛋白乙酰转移酶）

HDAC:histonedeacetylase（组蛋白脱乙酰酶）His-CaxHis-CaxTSA，不影响Cax对NFκB的抑制作用；NAM,可解除Cax对NFκB的抑制作用。

TSA，第一、二类组蛋白脱乙酰酶（HDAC）的抑制剂；NAM,第三类HDAC的抑制剂。Cax是依赖于第三类HDAC活性的co-repressorHela细胞，anti-His纯化Cax体外表达GST-Cax,无HDAC活性Cax可募集HDAC活性（Recruitsdeactylaseactivity)CAX——HDAC活性？Anti-SIRT1Anti-HisAnti-SIRT1IPwithanti-HisTotalcelllysateVectorHis-CaxCax可募集第三类HDAC

SIRT1p50p65p50p65SIRT1CaxSIRT1药物A

已知NFκB有对抗细胞凋亡的作用，目前数据提示Cax可能通过抑制NFκB的活化，从而具有促进细胞凋亡的作用要证实这一点，需对细胞内Cax的水平进行干预，考察NFκB活化和细胞凋亡的情况干预方法：正：过度表达

负：siRNADominantNegativeMutant当然，也可以制备Cax转基因小鼠或Cax基因剔除小鼠DominantNegativeMutant(负显性突变)：对影响蛋白质功能的关键位点进行突变，所得突变体不仅丧失了原有功能，并且可以抑制内源性蛋白质的功能。例如，对Cax和SIRT1的结合位点进行研究后，发现某个位点的氨基酸对Cax募集SIRT1的功能非常重要，该氨基酸突变后，Cax丧失了募集SIRT1的功能。进一步研究发现，CaxM具有负显性功能，可促进NF–κB的激活,其机制可能是对内源性Cax的竞争性抑制。Anti-SIRT1Anti-HisAnti-SIRT1IPwithanti-HisTotalcelllysateVectorHis-CaxHis-CaxM

ControlTNF

Luciferaseactivity(fold)VectorHis-CaxHis-CaxMp50p65p50p65SIRT1内源性CaxSIRT1外源性CaxM内源性Cax?siRNA(smallinterferingRNA)或RNAi(RNAinterference)的原理siRNA的设计:可进入各生物公司网站在线设计或请专业公司设计siRNA如何转入细胞:瞬时和稳定转染siRNA效果鉴定:NorthernBlot或WesternBlotCax沉默促进由TNFalpha刺激引起的NFκB-依赖的转录CaxAnnexinV-FITCPIControl药物A+化疗药

CaxsiRNA

ControlsiRNACaxsilencingdecreasestheapoptoticcellsp50p65SIRT1内源性CaxCaxreconstitutioncouldrescuetheapoptoticsusceptibilityofcellstoTNF

Cax*isresistantfordegradationinducedbysiRNA.ItssequencehasmultiplenucleotidesubstitutionswithinthesiRNAbindingsite,butretainthecodingofidenticalaminoacidsasthewildtypeCax,toallowforreconstitutioninthesiRNAenvironmentHis-Cax*Anti-His

WT:5’CAAAGCGTGGACCTGGTCTTCCCT3’;Mutant:5’CAgtcCGTaGattTaGTaTTtCCg3’

forthesameaminoacidssequence:QSVDLVFP

现在我们可以得出结论:1.Cax具有促进细胞凋亡的作用2.药物A通过诱导Cax表达的增加,增强肿瘤细胞对化疗诱导凋亡的敏感性3.Cax促进细胞凋亡的机制可能是抑制了NFκB的激活研究蛋白质在细胞内的活动情况需要从哪些方面入手？通常有哪些实验手段可以用来研究蛋白和蛋白的相互作用？通常有哪些实验手段可以用来研究蛋白和DNA的相互作用？何为报告基因?其有哪些研究用途？可用哪些技术对细胞内某个蛋白的水平进行干预?它们有什么区别?负显性突变：对影响蛋白质功能的关键位点进行突变，所得突变体不仅丧失了原有功能，并且可以抑制内源性蛋白质的功能。DNAmicroarray：是一种用于分子生物学和医学领域的高通量技术.它由一系列成千上万个精微的DNA寡核苷酸点排列而成，这些DNA寡核苷酸含有百亿分之一摩尔特定序列的。它们或者是一小截基因，或者是DNA的其他成分。它们被作为探针，在非常严格的条件下和一个叫做靶分子的cDNA或cRNA样本杂交。由于靶分子带有荧光标记，因此通过探针-靶分子的杂交，并根据杂交后荧光的有或无，强或弱，对靶分子中特定核酸序列的丰度进行检测。共激活因子：是一种蛋白，本身不能与DNA结合，但能够通过与具有DNA结合结构域的激活因子（或转录因子）结合来增强基因的表达。共激活因子可调节转录的许多其他过程，如转录的延长、终止、RNA剪接以及激活因子和共激活因子复合体的降解等。报告基因:是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控。

染色质免疫沉淀技术:研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免