转染adapa的骨髓源性肝干细胞的效率及对bdlsc增殖和分化的影响

转染adapa的骨髓源性肝干细胞的效率及对bdlsc增殖和分化的影响

尿激酶（urokiansudriv）对降低纤维组织和逆转肝脏纤维有重要作用。uPA不仅可通过纤溶酶及基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)构成的级联激活降解细胞外基质(extracellularmatrix,ECM),还可活化肝细胞生长因子(hepaticgrowthfactor,HGF),促进肝细胞再生。因而上调uPA活性成为肝纤维化治疗的一个新途径。近年,随着对骨髓源性肝干细胞(bonemarrow-derivedliverstemcell,BDLSC)研究的深入,发现BDLSC具有自我更新和多潜能分化的双重特性,加之易于采集、回输,是基因治疗肝脏疾病理想的靶细胞。我们拟用腺病毒介导的uPA体外转染BDLSC,尝试体内治疗大鼠肝纤维化模型。uPA促进纤维间隔的降解,为BDLSC提供种植生长的空间,有利于BDLSC增殖、融合和分化为肝细胞,促进肝组织形态修复和功能恢复。因而,细胞治疗与uPA基因治疗结合起来,有可能更好地抑制肝纤维化发生发展。材料和方法一、动物和主要试剂1.实验动物纯系Fisher344雄性大鼠(体重150～180g),购自中科院上海斯莱克实验动物有限责任公司。2.逆转录酶、taqcda和凝血清胞白蛋白(Albumin)兔多克隆抗体购自丹麦DAKO公司,DAKO公司羊抗兔TRITC标记的二抗购自美国Zymed公司,小鼠抗人uPA单克隆抗体购自美国LabVision公司。Trizol购自Invitrogen公司,M-MLV逆转录酶购自美国Promega公司。TaqDNA聚合酶购自Takara公司。DMEM/F12基础培养液:10%胎牛血清(Hyclone公司),20mMHepes、10-7mol/L地塞米松、10mg/L胰岛素-转铁蛋白-硒酸钠混合物(Insulin-transferrin-sodiumselenatemediasupplement,ITS),25μg/LHGF(PeproTech公司)。淤胆血清的制备:胆总管结扎10天后取骨髓细胞前麻醉状态下经门静脉取血,全血置37℃水浴30min,见血清析出,2000r/min离心10min,吸取上层血清,过滤除菌,56℃中灭活30min,-20℃中保存备用。病理条件培养液:将DMEM基础培养液中10%胎牛血清换为5%的自制淤胆血清。二、选择和鉴定adupa中的染色1.林勇博士惠赠经皮人pAduPA重组腺病毒质粒和pAdGFP重组空载质粒由第二军医大学附属长征医院林勇博士惠赠。利用脂质体转染法在293细胞中包装和扩增,用氯化铯梯度离心纯化,AduPA最终病毒滴度可达3×1012pfu/ml。2.细胞活力检测取胆总管结扎10天的F344雄性大鼠,乙醚麻醉,背位固定大鼠,经下腔静脉取血(用于制备淤胆血清)后,无菌解剖双侧股骨和胫骨,去除骨上附着的软组织,离断两端骨骺,用5ml注射器吸取无血清培养液,反复将骨髓冲出,吹打成单细胞悬液。另取一个15ml无菌离心管中,加入密度为1.077g/cm3的淋巴细胞分离液,将收集的细胞悬液缓慢加在分离液上部,3000r/min离心30min,用吸管将分界层细胞吸入至另一无菌离心管中。用PBS液洗2次,取少量细胞经台盼蓝染色,观察细胞活力。用DMEM/F12基础培养液按2×105个/cm2密度接种细胞于T-25cm2培养瓶中。72h后首次换液,而后换病理条件培养液持续培养,每3～4天换液,7～10天首次传代。3.相关指标表达取培养2周的大鼠骨髓细胞以5×105/孔接种于6孔板,培养24h后收集骨髓细胞,用Trizol试剂提取细胞总RNA。取1μg细胞总RNA按逆转录试剂盒合成cDNA第一链,以2μl逆转录产物为模板进行PCR扩增。再行PCR反应检测白蛋白、AFP、CKl8、细胞色素P4502B1(cytochromeP4502B1,CYP2B1)、转甲状腺素蛋白(transthyretin,TTR)、肝细胞核因子-1a(hepatocytenuclearfactor-1a,HNF-la)、肝细胞核因子-3β(hepatocytenuclearfactor,HNF-3β)、白蛋白转录因子CCAAT/增强结合蛋白a(CCAAT/enhancerbindingproteina,C/EBPa)肝细胞特征蛋白mRNA的表达。各指标引物序列、退火温度及扩增产物长度见附表。PCR反应条件:94℃预变性5min后进入PCR反应循环:94℃中变性30秒,不同的温度退火30秒,72℃中延伸1min,共30个循环;循环结束后在72℃中延伸7min。各RT-PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。4.ad回复突变试验培养2周后BDLSC以5×103/孔接种于六孔培养板,继续培养24h后将AduPA分别以MOI10、50、100、200、500及1000滴度感染BDLSC,3d后荧光显微镜观察GFP表达。荧光显微镜下随机计数4个视野,计算GFP表达细胞个数/细胞总数,以选取最佳转染效率。5.检测内容和方法培养2周后BDLSC以5×103/孔接种于六孔培养板,继续培养24h后按每组3复孔分为3组:①单纯细胞培养组:不作处理;②AdGFP组:取对照病毒AdGFP以MOI500滴度感染BDLSC;③AduPA组:取病毒AduPA以MOI500滴度感染BDLSC。提取分组处理后的BDLSC总蛋白分别标准定量后,各取20μg于10%SDS电泳分离蛋白,将PVDF膜置甲醇中浸泡1min,转移缓冲液中浸泡15min,将电泳胶、PVDF膜、滤纸放于膜转移缓冲液中平衡后,置于电转移槽中,于1OV转移15min。使用5%BSA/TBST20ml室温封闭1h,小鼠抗人uPA单克隆抗体(1∶200),兔抗大鼠β-actin抗体(1∶1000)于4℃中孵育过夜。次日用TBST洗涤后,与辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5000)在室温下孵育2h,用TBST洗涤。将SuperSignalRwestPic化学发光检测试剂A液(增强剂)和B液(发光底物)以1∶1的比例混合,覆盖膜表面,室温中避光放置5min;吸干膜上多余试剂,保鲜膜封闭后,在暗室内压片显影,结果扫描入计算机。三、adupa转移检测布鲁斯lc的克隆和分裂影响指标1.dmem培养液制备取培养2周后BDLSC以5×103/孔接种于96孔板,以含10%胎牛血清的DMEM液培养24h后换用含2%胎牛血清的DMEM培养液。继续培养24h后按每组8复孔分为4组处理:三组同上,另增设空白对照组(只加等量培养液,无细胞),24h后更换新鲜DMEM培液,72h后每孔加入MTF溶液至终浓度0.5μg/ml,37℃中继续培养4h后,吸弃培养液,然后每孔加入DMSO150μl,振荡10min,使结晶物充分溶解。使用酶标仪于490nm波长测定各孔OD值,用以代表BDLSC增殖率。2.tri能力检测将灭菌的细胞爬片置于24孔板中,培养2周的大鼠骨髓细胞以1×105/孔接种于24孔板,培养24h,用AduPA以MOI500转染骨髓细胞,继续培养72h后取出爬片,用PBS液洗2次,加入4%多聚甲醛在室温下固定10min;用PBS液冲洗5min×3次,0.1%TritonX-100/PBS室温下孵育10min;用PBS液洗5min×3次,加正常封闭羊血清,以阻断非特异性反应;加一抗(白蛋白:1∶1000稀释)50μl,4℃中过夜;用PBS液冲洗5min×3次,加对应的二抗50μl,室温下孵育2h;荧光显微镜下观察,用PBS液适时中止反应;加1μg/μlDAPI50μl室温下复染10min,用PBS液中止反应,50%缓冲甘油封片。荧光显微镜下观察,细胞呈现绿色荧光代表病毒转染,胞浆呈现红色荧光代表白蛋白表达。四、统计处理计量资料用ˉx±sx¯±s表示,采用SPSS10.0统计学软件进行方差分析。P<0.05为显著性界值。结果一、细胞分化和分离采用淋巴分离液进行密度梯度离心法分离胆总管结扎后10天大鼠骨髓单个核细胞,分离后立即用含HGF和10%胎牛血清为主的DMEM/F12培养液孵育,培养48h,出现贴壁细胞,胞体伸展。72h后细胞大部分贴壁,换病理条件培养液后出现部分细胞凋亡脱落,残留细胞逐步分化形成肝细胞样集落,继续分化扩增10～14d后可见分散的较大的克隆样增殖的肝细胞样集落,细胞呈多边形或不规则形(图1)。RT-PCR显示培养2周的骨髓细胞白蛋白、AFP、CKl8、CYP2B1、TTR、HNF-1a、HNF-3β、C/EBPa胚胎期肝细胞特征蛋白mRNA表达均为阳性(图2)。二、adupa检测gfp表达将AduPA分别以MOI10、50、100、500及1000滴度感染BDLSC,3天后荧光显微镜观察GFP表达(照片3)。可见随着病毒感染滴度的增高,GFP的表达呈增高趋势。当MOI为500时,AduPA转染阳性细胞数72h表达最强可达92.6±2.2%,而MOI为1000时,虽然转染阳性细胞数可达99.5±1.8%,但出现大量细胞死亡。故选取MOI500为最佳转染病毒滴度(图3、4)。三、产液位检测aspa在bdlc中的发现与AdGFP组和单纯细胞培养组相比,AduPA感染BDLSC细胞3天后显示uPA在BDLSC中表达阳性,对照组未见表达(图5)。四、mtt法检测转移瘤亚硝基亚硝基亚硝基亚硝基亚麻布的生长MTT检测显示,与单纯BDLSC培养和转染AdGFP组相比,AduPA转染BDLSC后,对BDLSC的增殖无明显影响(附表)。五、gfp的表达将AduPA和AdGFP以MOI500滴度体外感染培养2周的BDLSC,3天后在荧光显微镜下可见GFP表达。免疫细胞化学染色结果显示转染AduPA后的BDLSC仍表达白蛋白,胞浆呈红色荧光(图6)。基因修饰干细胞移植近年,随着干细胞研究的深入,发现干细胞具有自我更新和多潜能分化的双重特性,加之易于采集、回输,是基因治疗理想的靶细胞,从而出现了基因治疗与干细胞治疗相结合的应用研究。将外源性基因导入干细胞的研究近年开始增多,其目的主要有:①促进干细胞分化;②作为基因治疗细胞载体;③干细胞基因修饰后增强某基因表达,对其进行功能改造以适应治疗的需要。脑源性神经营养因子修饰MSC移植治疗脑缺血,转染IL-2的MSC移植治疗脑神经胶质瘤等,这些均是基因修饰干细胞移植治疗的有益尝试。基因修饰干细胞移植为治疗各种疾病提供了广阔的前景。BDLSC增殖能力强,在体内外均有极强的向肝系细胞分化的能力,目前成为治疗肝病的理想载体细胞。uPA在发挥纤维降解作用逆转肝纤维化中起重要作用。由uPA、纤溶酶及MMPs构成的级联激活反应是调节ECM沉积的主要途径。uPA通过激活纤溶酶原转变为纤溶酶,纤溶酶不但能直接降解ECM,还可激活MMPs和间质胶原酶,促进细胞外基质成分降解。此外,uPA还可活化HGF,后者可促进肝干细胞分化和肝细胞再生。因而uPA已被应用于肝纤维化基因治疗的实验研究中。我们设想BDLSC与uPA基因治疗联合应用时,uPA参与清除坏死组织及降解纤维间隔,为BDLSC的种植生长提供空间,有利于肝干细胞增殖、融合和分化为肝细胞,可能促进肝组织功能恢复。我们初