hplc-dad-elsd法同时测定复方瓜子金颗粒中秦皮乙素、蒙花苷和polygalesaponinxxi的含量

hplc-dad-elsd法同时测定复方瓜子金颗粒中秦皮乙素、蒙花苷和polygalesaponinxxi的含量

瓜子金属、苦艾酒和海金沙、蛇舌草和紫花地黄的提取物包括6种药物，具有清热、利咽、止泻、止咳、止咳等功效。用于慢性咽炎和其他呼吸道感染。复方体现的是整体协同作用,方中瓜子金为主药,其皂苷类成分是发挥抗炎活性的主要成分;蒙花苷又名野菊花黄酮苷,对金黄色葡萄球菌和乙型溶血链球菌具有一定的抑制作用,是野菊花药材的指标性成分,也是复方中的含量较高的成分;紫花地丁中主要含香豆素类成分,其中秦皮乙素具有明显的抗炎作用。因此,研究这几个化合物的检测方法对于全面控制复方瓜子金颗粒的质量有着重要的意义。由于秦皮乙素和蒙花苷有很强的紫外吸收,故检测的主要方法是HPLC-UV法,而瓜子金皂苷只有弱的末端吸收,HPLC-ELSD法是测定其含量的有效方法。目前,2005年版中国药典中对于复方瓜子金颗粒质量控制的含量测定部分,主要是应用HPLC-UV法对方中紫花地丁的秦皮乙素进行控制,使用HPLC-DAD-ELSD法对复方瓜子金颗粒中秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI的同时测定尚未见文献报道。本文将HPLC-DAD-ELSD联用技术用于复方瓜子金颗粒中秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI的同时测定,其中秦皮乙素和蒙花苷采用HPLC-DAD法测定、polygalasaponinXXI采用HPLC-ELSD法测定。1标准1:dkma法高效液相色谱仪:Waters600泵,Waters996二极管阵列检测器,Alltech2000ES蒸发光散射检测器,Millennium32工作站;色谱柱:DiamonsilC18(250mrn×4.6mm,5μm)。乙腈:DikmaPure,DimaTechnologyINC,美国;甲醇:色谱纯,江苏汉邦科技有限公司;水:乐百氏纯净水;三氟醋酸:分析纯,国药集团化学试剂有限公司,其他试剂均为分析纯。秦皮乙素对照品,购自中国药品生物制品检定所,批号741-200105,纯度>98.0%;蒙花苷对照品,自制,经核磁和质谱鉴定,HPLC面积归一法测定,纯度>98.0%;polygalasaponinXXI对照品,自制,经核磁和质谱鉴定,HPLC面积归一法测定,纯度>98.0%。复方瓜子金颗粒为市售药品,规格分别为5,10,20g·袋-1。2方法和结果2.1溶液制备2.1.1单一对照品溶液取对照品适量,精密称定,加入甲醇溶解制成950μg·mL-1秦皮乙素、402μg·mL-1蒙花苷和628μg·mL-1polygalasaponinXXI的单一对照品储备液。其他不同质量浓度的对照品溶液由储备液稀释混合得到。2.1.2滤膜滤膜制备复方瓜子金颗粒研细后取5g,精密称定,置磨口三角瓶中,加入甲醇25mL后称重,于80℃回流6h后,放冷,再称重,甲醇补重,摇匀后经0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液备用。2.1.3阴性样品溶液的制备按处方比例制备不含瓜子金、野菊花和紫花地丁的阴性样品,依“2.1.2”项下方法操作,得缺瓜子金、野菊花和紫花地丁的阴性样品溶液,备用。2.2瓜子金颗粒、湿地松的色谱条件色谱柱:DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈(A)-0.05%三氟醋酸水溶液(B),梯度程序为0～10min(15%A),10～30min(15%A→28%A),30～40min(28%A),40～50min(28%A→32%A);流速:1.0mL·min-1;柱温:30℃;进样量:20μL;DAD检测波长:340nm;ELSD参数:漂移管温度105℃,载气流速2.6L·min-1。在上述色谱条件下进样分析,理论塔板数按秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI色谱峰计算分别不低于4000,4000,2000;3个成分色谱峰与其相邻色谱峰之间分离度均大于1.5,拖尾因子均在0.95～1.05之间。测得对照品、瓜子金颗粒样品和阴性样品色谱见图1。结果表明阴性样品色谱中,在与秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI相同的保留时间处均无吸收峰。A=5.683×104C+8.407×103r=0.9998A=2.730×104C+6.225×103r=0.9999lnA=1.663lnC+5.852r=0.9993线性范围分别为4.75～118,75μg·mL-1,4.02～100.50μg·mL-1,19.62～157.00μg·mL-1。2.4rsd测定取中间浓度的混合对照品溶液,在上述色谱条件下重复进样6次,记录秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI的峰面积,计算RSD(n=6)分别为1.5%,1.4%,1.6%。2.5秦皮乙素、蒙花苷、polygalusaponinxi的平均含量取同一批复方瓜子金颗粒5g共6份,精密称定,依“2.1.2”项下方法操作,在上述色谱条件下分析测定。秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI的平均含量(n=6)分别为0.162,0.135,0.142mg·g-1;RSD分别为1.9%,1.2%,2.7%。2.7标准曲线及峰面积的测定取复方瓜子金颗粒粉末5g,精密称定,按“2.1.2”项下方法操作,得供试品溶液,在室温下放置。在上述色谱条件下,分别于0,4,8,12,24,48h测定。计算秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI色谱峰面积的RSD分别为2.3%,1.5%,2.8%。结果表明,供试品溶液在48h内稳定。2.8供试品溶液测定取不同批次的复方瓜子金颗粒样品粉末5g,共10批,精密称定,按“2.1.2”项下方法操作,得供试品溶液,分别在上述色谱条件下进行分析测定,外标两点法计算含量,结果见表1。3讨论3.1流动相系统洗脱曾考察过甲醇-酸水溶液、乙腈-酸水溶液等不同的流动相系统,当以乙腈-三氟醋酸水溶液为流动相系统时峰形好;由于所测3个组分极性相差较大,故采用梯度洗脱。对乙腈—0.05%三氟醋酸水溶液体系多次考察结果显示,在文中所述的梯度洗脱程序下,复方瓜子金颗粒样品中秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI的分离效果最佳。3.2elsd参数的确定实验中采用二极管阵列检测器对秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI对照品溶液在190～400nm波长范围内进行了紫外吸收扫描,得到秦皮乙素、蒙花苷的最大吸收波长分别为345和334nm,故选择了340nm作为两者的检测波长。而对于相同浓度的polygalasaponinXXI,在ELSD上的响应远大于在DAD最大吸收波长处的响应,相反,相同浓度的秦皮乙素和蒙花苷在ELSD上的响应远小于在DAD上的响应。因此,在本试验中,polygalasaponinXXI采用HPLC-ELSD法测定,而秦皮乙素和蒙花苷则采用HPLC-DAD法测定。在ELSD参数的选择时,我们在推荐的参数(108.3℃,3.0L·min-1)基础上进行了优化。实验中曾评价了漂移管温度90～110℃和载气流速从2.2～3.0L·min-1时polygalasaponinXXI的响应值,结果显示最合适的漂移管温度是105℃。一般来说,载气流速越低,响应越强,但在实验中发现,当载气流速降至2.4L·min-1时基线噪音较大,故最终选择了2.6L·min-1。蒸发光散射检测器的参数定为漂移管温度105℃、载气流速2.6L·min-1,在实验中应严格控制这2个参数,对于分析方法的重复性和准确性很重要。3.3polygalusaponinxi试验复方瓜子金颗粒疗效确切,已被列为国家中药保护品种,2005年版中国药典中规定通过测定其中的秦皮乙素含量来控制质量。而对于复方中的主药瓜子金、野菊花等目前尚未建立有效的质量控制方法。本实验首次建立了采用HPLC-DAD-ELSD联用技术同时测定复方瓜子金颗粒中秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI含量的分析方法,其中蒙花苷和polygalasaponinXXI分别来源于方中的主药瓜子金和野菊花。与单独采用HPLC-DAD或HPLC-ELSD的方法相比较,本方法具有可同时灵敏、准确地测定复方瓜子金颗粒中的秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXI的优点,对于有效控制复方瓜子金颗粒的质量提供了可靠的评价方法。取上述对照品储备液,用甲醇稀释,配成秦皮乙素质量浓度分别为118.75,59.38,23.75,11.87,4.75μg·mL—1;蒙花苷质量浓度分别为100.5,50.25,20.1,10.05,4.02μg·mL-1;polygalasaponinXXI质量浓度分别为157.0,78.5,39.25,26.17,19.62μg·mL-1的混合对照品溶液。分别精密吸取此系列混合对照品溶液在上述色谱条件下进行分析。对于秦皮乙素和蒙花苷,以对照品溶液浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线并进行回归分析。对于polygalasaponinXXI,分别取对照品溶液浓度的自然对数和峰面积的自然对数为横坐标和纵坐标,绘制标准曲线并进行回归分析。结果秦皮乙素、蒙花苷和polygalasaponinXXl的回归方程分别为:2.3线性关系研究2.6计算回收率和rsd取已知含量的复方瓜子金颗粒(批号:JS-050216)粉末9份,每份2.5g,精密称定,3份为一组,每组分别加入低(80%)、中(100%)、高(120%)3个浓度的对照品溶液,按“2.1.2”项下方法制备溶液,在上述色谱条件下分析测定。计算回收率和RSD。秦皮乙素低、中、高浓度的回收率(n=3)分别为102.7%(RSD=2.6%),103.0%(RSD=1.3%),102.5%(RSD=