首乌方与美多芭对帕金森病模型大鼠脑内微透析及脑内纹状体神经化学作用的比较

首乌方与美多芭对帕金森病模型大鼠脑内微透析及脑内纹状体神经化学作用的比较

乌乌配方主要用于肝肾经络的何首乌和鹿毛，具有肝肾、强筋和强骨的功效。辅以天麻、钩藤、平肝祛风；以厚朴为基础，祛瘀消粘液，补充肝肾、精血、祛风止息作用。是在中医理论指导下针对帕金森病(PD)病机优选的自拟中药组方。应用本方配合美多芭临床治疗70例PD患者,取得了比单用美多芭组更为显著的临床血糖-浓度-时间曲线下面积(AUC)疗效。我课题组近期应用血、脑双位点微透析采样技术,同步观察6-羟基多巴胺(6-OHDA)所致的PD大鼠模型血液和纹状体细胞外液中左旋多巴(L-DOPA)药代动力学的结果表明:首乌方可改善L-DOPA的药代动力学指标,提高血药浓度,增加AUC,并使其体内滞留时间延长;稳定纹状体细胞外液L-DOPA药物浓度,减少其波动,减慢L-DOPA的消除。本文就首乌方与美多芭(L-DOPA的复方制剂)同用对PD模型大鼠纹状体细胞外液神经化学物质的影响,采用应用清醒自由活动大鼠脑内微透析及其相关检测技术,从PD模型大鼠纹状体细胞外液神经化学物质水平进行探讨,为临床中西医结合治疗PD增效减毒的机制提供药理学依据。1材料表面1.1动物SD大鼠,雄性,体重200～250g,中国药品生物制品检定所,许可证号SCXK(京)2005-0004。1.2水提物的提取效果首乌方(何首乌20g,鹿茸2g,天麻10g,钩藤15g,厚朴15g)为本实验室自制:按常规水煎2次,合并、浓缩后加入鹿茸匀浆,为含生药量1.8g·mL-1的水提物。L-DOPA注射液(上海福达制药有限公司产品,批号040701),复方氯化钠注射液(北京双鹤药业股份有限公司产品,批号0807092),盐酸苄丝肼、水杨酸钠、6-羟基多巴胺、辛烷磺酸钠、磷酸、多巴胺(DA)、3,4二羟基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、2,3-二羟基苯甲酸(2,3-DHBA)、2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHBA)、高氯酸(HCLO4)均购自Sigma公司,乙腈、乙酸和甲醇(FisherChemicals公司产品)。1.3ma/400低温样品自动收集器和转化动物活动装置微透析系统CMA/12脑部探针(透析膜长4mm)及探针套管、CMA/402微量泵、CMA/470低温样品自动收集器(瑞典CMA公司),五通转环清醒动物活动装置(美国Instech公司)。手术使用设备:立体定位仪STRONG8003、动物体温维持仪269001、颅钻/90-102(深圳瑞沃德公司)。高效液相色谱检测系统(德国SykamS-2100)。2方法2.1目的物的提取大鼠随机分为4组,对照组、模型组、美多芭组、首乌方+美多芭组,每组6只。大鼠ip1%戊巴比妥钠(40mg·kg-1),于麻醉下埋入探针套管于纹状体内(A:+0.2mm,L:+3mm,V:7.5mm),用牙科水泥固定。各造模组向纹状体缓慢ip0.2%的6-OHDA生理盐水溶液(32μg·kg-1,1μL·min-1),对照组ip相应体积的生理盐水。造模当天开始ig投药至第6天,美多芭组30mg·kg-1,(L-DOPA24mg·kg-1、盐酸苄丝肼6mg·kg-1);首乌方+美多芭组:首乌方水提物(生药量:18g·kg-1·d-1)+美多芭(用量同前);其他组ig等量常水,每日1次。第7天于大鼠清醒自由活动状态下插入脑探针,进行脑内微透析。脑内探针用5mmol·L-1水杨酸钠林格液灌流,灌流速度均为2.5μL·min-1,平衡60min之后开始收集透析液,每15min收集1管。取前4管透析液测定目标检测物,计算均值作为基础水平(0min)。之后,给药组大鼠ip美多芭注射液(配比及给药剂量同前),对照组和模型组ip等量生理盐水,收集纹状体透析液至给药后360min。2.2分析柱和催化剂高效液相色谱-电化学(HPLC-ED)法测定纹状体透析液中DA,HVA,2,3DHBA,2,5DHBA含量。色谱柱为AntecLeydenBVC18分析柱(2.1mm×100mm,3μm)。AntecDecadeⅡSDC电化学检测器,玻璃碳电极和Ag/AgCl参考电极,工作电压为0.52V。流动相乙二胺四乙酸二钠(0.027mmol·L-1)、辛烷磺酸钠(0.74mmol·L-1)、氯化钾(2mmol·L-1)、磷酸二氢钠(100mmol·L-1)、甲醇(15%)、乙睛(1%)、乙酸(0.05%),用磷酸调pH至3.32。流速0.2mL·min-1,进样量20μL。2.3探针的体外回收率将探针放置于DA,DOPAC,HVA,2,3-DHBA,2,5-DHBA的混合标准液中,保持温度为37℃,用复方氯化钠2.5μL·min-1灌流,每15min1管,连续收集透析液,共3管,HPLC-ED法测定体外透析液中上述物质的浓度。每种物质的探针体外回收率=(3管透析液该物质浓度均值/3管标准液该物质浓度均值)×100%。体外回收率用于折算脑微透析液中目标检测物的浓度。2.4单因素方差分析计量资料以x¯±sx¯±s表示,多组比较采用SPSSforwindows16.0软件进行单因素方差分析。P<0.05有统计学意义。3结果3.1各组da基础水平的比较6-OHDA造模使模型组纹状体细胞外液DA水平在基础和给药后多个时间点较对照组显著降低(P<0.05或P<0.01)。美多芭、首乌方+美多芭投药6日使DA基础水平均较模型组显著升高(P<0.05或P<0.01),两组间无显著差异。腹腔注射美多芭后,两组DA水平均迅速升高,然后缓慢回落。与模型组相比,美多芭组有5个时间点显著升高(P<0.05),首乌方+美多芭组有14个时间点显著升高(P<0.05,P<0.01),且在30min时高于美多芭组(P<0.05),见表1。3.2模型组和模型组hva/da的比率PD大鼠纹状体细胞外液DOPAC/DA,HVA/DA比率反映DA代谢速率。6-OHDA造模后第7天,模型组DOPAC/DA,HVA/DA比率较对照组升高(P<0.05,P<0.01),而美多芭组、首乌方+美多芭组较模型组降低(P<0.01)。ip美多芭后,由于DA水平升高,两组的两个比率一过性降低,之后伴随DA的代谢、DOPAC,HVA水平增高,两个比率均随之升高,组间无差异。首乌方对腹腔注射美多芭后DA代谢速率动态变化情况无显著影响。3.3l-dopa抑制活性为能清晰反映单次给药后纹状体细胞外液DA水平波动情况,以给药6日后测得0min的DA浓度作为基础,用(给药后各时间点的DA浓度-基础浓度)/基础浓度,反映给药后DA的变化率(ΔDA),结果如表2所示。对照组和模型组ip生理盐水后,ΔDA动态变化较小,为生理性波动;ip美多芭后,ΔDA有8个时间点较模型显著升高(P<0.05,P<0.01),表明外源性L-DOPA引起的DA波动性较大;而首乌方+美多芭组因其DA基础水平较高,ΔDA只有3个时间点较模型组显著升高(P<0.05,P<0.01),且大多时间点的变化幅度低于美多芭组,见表2。由此可见首乌方使PD模型大鼠纹状体细胞外液DA浓度更长时间维持在较高水平,同时使L-DOPA引起的ΔDA经时曲线波动平缓,从而减少DA受体的脉冲样刺激。3.4模型和模型的比较2,3-DHBA与2,5-DHBA为羟自由基指标,二者之和反映羟自由基总水平。模型组大鼠纹状体细胞外液2,3-DHBA+2,5-DHBA浓度较对照组升高,7个时间点有显著意义(P<0.05,P<0.01)。美多芭组、首乌方+美多芭组与模型组相比,基础水平降低(P<0.05),并在腹腔注射美多芭后,持续低于模型组,分别有4个和20个时间点有显著性意义(P<0.05,P<0.01)。首乌方+美多芭组在观察时间内各点始终低于美多芭组,其中9个时间点有显著性意义(P<0.05),见表3。4如何高效地使用l-dopa,保护da神经元目前,PD最为常用和有效的治疗药物仍是L-DOPA及其复方制剂。它可以在体内转化为DA,发挥替代治疗作用,可以减轻PD症状,延缓病程进展,延长患者寿命,是PD治疗史上的重大进展。可是随着用药时间延长和剂量加大,非但不能取得进一步的疗效,反而产生病人难以耐受的副作用。有研究表明,L-DOPA副作用产生的基础是PD的严重程度,始动因素是L-DOPA的波动性变化,引起纹状体DA受体“脉冲”样刺激;此外,PD导致机体自由基清除系统功能低下,外源性L-DOPA自身代谢过程中产生的羟自由基不能被有效清除,会进一步加重DA神经元的损伤。因此,如何科学合理地使用L-DOPA,以较小的剂量,发挥较大的生物效应,减少不良反应,是PD临床治疗和基础研究所面临的重要课题。以往的药理学研究显示,首乌方中的何首乌和鹿茸均具延缓衰老、抗氧化、抑制脑内单胺氧化酶-B、改善学习记忆等作用。何首乌尚促进细胞代谢、防止纹状体中间神经元数量减少,提高D2受体水平;鹿茸尚有神经生长因子样作用,能刺激神经纤维的生长,诱导分化期细胞形态的改变,使微管、微丝等管状细胞器开始增加,影响PC-12细胞的DNA合成。天麻、钩藤也有抑制血清和脑过氧化脂质生成、增强过氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性的作用等。但该复方与L-DOPA协同作用、减毒增效的机制未见报道。本实验在我室以往工作的基础上抓住PD进程和L-DOPA治疗过程中关键靶点和关键环节,应用先进的微透析采样技术,在观察首乌方对PD大鼠L-DOPA药动学影响的同时,观察对L-DOPA药效学、副作用的影响,深入探讨首乌方协同L-DOPA治疗PD的作用机制。研究结果表明首乌方在改善L-DOPA药代动力学过程的同时,增高纹状体细胞外液D