干细胞标记论文

SPIO标记人胚胎干细胞皮下注射小鼠的示踪研究【摘要】目的：探讨超顺磁性氧化铁微粒（SPIO）体外标记人胚胎干细胞（ESC）及体内示踪皮下注射裸鼠的人胚胎干细胞的能力。方法：使用硫酸鱼精蛋白-SPIO共培养方式标记人胚胎干细胞。采用显微镜观察干细胞标记情况，并进行富集纯化，将经过SPIO标记的干细胞皮下注射裸鼠体内，应用1．5TMRI系统进行磁标记干细胞成像。结果：初步标记后的人胚胎干细胞用显微镜观察，SPIO标记的干细胞细胞胞质内出现细小的黑色铁颗粒，标记效率为90％；标记了SPIO的人胚胎干细胞体内MRI成像时显示，细胞移植区域T2信号减弱。结论：SPIO能成功地标记ESC，SPIO标记的ESC皮下注射入小鼠体内的分布、迁移过程可用MRI进行检测评价。【关键词】干细胞移植；示踪；超顺磁性氧化铁；磁共振成像；标记近些年来，胚胎干细胞的研究一直是生物医学工程学中的热点。胚胎干(embryonicstem,ES)细胞因具有全能性和无限增殖的能力而有望成为组织工程中种子细胞的新来源[1]。但是,ESC目前尚不能真正应用于临床治疗,还有许多问题亟待解决。其中,较为突出的是如何对移植的干细胞进行长期的、无创伤的实时检测,从而了解其在体内的分布、迁徙、分化和转归等生物学行为。本实验用SPIO标记人的胚胎干细胞，并通过皮下注射小鼠体，用MRI检测其增殖分化特性。核磁共振成像(MagneticResonanceImaging，MRI)是分子影像学的一种技术，增加了本实验过程细胞移植的无创活体示踪的可行性。根据成像方法不同，分子成像主要包括核素分子成像、磁共振(magneticresonance,MR)分子成像、光学分子成像等。因MR成像具有无放射性,有较高的软组织分辨能力和良好的重复性而倍受推崇[2]。超顺磁性氧化铁微粒(superparamgneticironoxides，SPIO)为一种纳米分子探针，具有因良好的生物相容性和磁共振信号敏感性而被应用于该实验中。细胞通过吞噬、吞饮等方式将纳米粒子内吞于细胞体内，而对不具有吞噬能力或吞噬能力较弱的细胞,由于标记率低而不能直接将此类造影剂用于细胞的标记。磁性纳米粒子表面修饰被认为是磁性纳米粒子与细胞膜表面非特异性相互作用的关键因素,影响细胞标记率[1]，并且磁性粒子的粒径影响磁共振灵敏度，磁性纳米簇与单个纳米粒子相比能显著增强MRI信号[2-4]。本研究选择微米级超顺磁氧化铁颗粒(SPIO)标记小鼠胚胎干细胞(ESC)及其分化的心肌细胞并行MR显像，以检测标记的有效性和对细胞生物学活性影响。1材料与方法1．1材料裸鼠、硫酸鱼精蛋白、SPIO、1．5TMRI1．2方法1．2．1混合液的配制1.先称取10mg的硫酸鱼精蛋白溶于10ml的蒸馏水中；2.用枪吸取0.3ml的SPIO溶于20ml的无血清的培养基中；3.取1中已配制的溶液100ul加入2中溶液中，使硫酸鱼精蛋白浓度为5ug/ml；4.往3中的溶液加入等体积的双倍血清培养基，使最终SPIO的浓度为50ugFe/ml,即所需溶液。1．2．2干细胞的体外标记及富集6天之后，两种细胞长到大约整个瓶壁的60%，即用我们预先配制好的混合液给细胞换液，孵育过夜，接下第二天，观察磁珠标记的情况，并拍照，大多数细胞均被标记。为了得到更高的标记效率，第三天我们又进行了富集纯化，富集过程如下：1.用胰酶消化细胞，加入3ml的培养基，并将细胞转移到15ml的玻璃离心中，15000rpm离心5min，弃上清；2.加入新的培养基打匀细胞，用强力磁石富集，弃上清，重复2次；3.加入2.5ml新培养基打匀之后转移至小培养皿中，4小时之后细胞贴壁之后观察，并进行拍照，观察富集情况，对比富集前后的磁珠标记的情况，富集后几乎每个细胞均被标记。1.2.3收集标记的细胞，制成100ul悬液，皮下注射小鼠左腋下，2周后进行核磁共振成像2结果2．1SPIO标记干细胞的结果干细胞的超顺磁氧化铁颗粒标记：电镜显示ESC胞质内散在分布许多囊泡样结构即吞饮小泡，高密度铁颗粒主要集中在囊泡内，直径大约0．8～1．5m(图1)。镜检可见ESC胞浆内存在大量黑色的SPIO颗粒，细胞标记率为90％（图1）定位、存活数量、移植细胞的分化等。但组织学是有创检查，而且不能代表全部移植细胞的体内生存情况及其动态迁移[3]。干细胞移植的临床应用及相关科学研究需要合适的影像学方法对移植细胞在活体进行连续、无创的示踪观察[16]活体示踪移植干细胞的生存状态及迁移对阐明治疗效果的潜在机制及临床应用的实施有极其重要的作用。MR有良好的软组织及时间分辨率，无电离辐射，可以在示踪干细胞的同时评价干细胞移植的治疗效果，MR透视引导下精确移植定位的研究已见报道[17]。MRI因其诸多优势在活体干细胞监测领域成为研究热点。SPIO对标记细胞毒性低，细胞增殖不受影响。与未标记细胞相比，标记干细胞的细胞活性差异无统计学意义，与文献报道结果一致［18］。参考文献[1]沈干，从笑倩，汪铮，吴春芳，曹谊林小鼠胚胎干细胞建系及GFP标记东南大学学报.2003,Mar;22(2):71O74,88[2]MatuszewskiL,TombachB,HeindelW,etal.Molecularandparame-tricimagingwithironoxides[J].Radiologe,2007,47(1):34-42.[3]FrankJA,MillerBR,ArbabAS,etal.Clinicallyapplicablelabelingofmammalianandstemcellsbycombiningsuperparamagneticironoxidesandtransfectionagents.Radiology.2003;228(2):480-487.[4]ArbabAS,BashawLA,MillerBR,etal.CharacterizationofbiophysicalandmetabolicpropertiesofcellslabeledwithsuperparamagneticironoxidenanoparticlesandtransfectionagentforcellularMRimaging.Radiology.2003;229(3):838-846.[5]BosC,DelmasY,DesmoulièreA,etal.InvivoMRimagingofintravascularlyinjectedmagneticallylabeledmesenchymalstemcellsinratkidneyandliver.Radiology.2004;233(3):781-789.[6]KosturaL,KraitchmanDL,MackayAM,etal.Feridexlabelingofmesenchymalstemcellsinhibitschondrogenesisbutnotadipogenesisorosteogenesis.NMRBiomed.2004;17(7):513-517.[7]BulteJW，KraitchmanDL.IronoxideMRcontrastagentsformolecularandcellularimaging[J].NMRBiomed,2004,17(7):484-499.[8]EmeritJ,BeaumontC,TrivinF.Ironmetabolism,freeradicals,andoxidativeinjury[J].BiomedPharmacother,2001,55(6):333-339.[9]LuCW,HungY,HsiaoJK,etal.Bifunctionalmagneticsilicananoparticlesforhighlyefficienthumanstemcelllabeling[J].NanoLett,2007,7(1):149-154.[10]Daldrup-LinkHE,RudeliusM,OostendorpRA,etal.TargetingofhematopoieticprogenitorcellswithMRcontrastagents[J].Radiology,2003,228(3):760-767.[11]金旭红，杨柳，段小军，等．体外纳米磁带标注骨髓间充质干细胞生特学特性及其MR成像［J］．第三军医大学学报，2008，30（4）：275－279．[12]刘再毅，王瑛，王广谊，等．超顺磁性氧化铁标记脂肪干细胞移植入大鼠心脏后的活体磁共振示踪成像［J］．中国医学科学院学报，2009，31（2）：187－191．[13]NeriM，MademaC，CavazzinC，etal．Eficientinvitrolabelingofhumanneuralprecursorcellswithsuperparagnetieironoxideparticles：relevanceforinvivocelltracking［J］．StemCell，2008，26（2）：505－516．[14]黄铀新，吕富荣，吕发金，等．超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓问充质干细胞的磁共振成像研究［J］．重庆医科大学学报，2009，34（3）：318－321．[15]KraitchmanDL,BulteJW.ImagingofstemcellsusingMRI.BasicResCardiol.2008;103(2):105-113.[16]BaiX,AltE.Myocardialregenerationpotentialofadiposetissue-derivedstemcells.BiochemBiophysResCommun.2010;