分子克隆实验标准步骤

分子克隆实验标准步骤常规分子克隆实验流程：?确定目的片段的基因序列以及需要插入的载体?引物设计软件或网站设计引物?pcr扩增目的基因片段?pcr产物的回收?载体的酶切?插入片段的酶切（重组不需要酶切）引物设计pcr扩增酶切连接或重组?载体与目的片段的连接或重组?连接或重组产物转化大肠杆菌感受态?涂布平板?平板菌落的鉴定?阳性克隆送测序?测序结果的分析变换识别序列比对二、分子克隆实验标准步骤（含实验编号）：1•靶基因（克隆酶T）的PCR扩增以本实验室常用酶kod-plus-neo（toyobo）为例体系（50ul）：10Xkodbuf5uldntp（2mm）5ulmg2+3ulprimer11ulprimer21ultemplate50-200ngkod0.5ulDDH2O50ul程序：95°C2min98°C10s58°C30s35cycle68°C2kb/min68°C7min12°Cspcr产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号clonesop-2）琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三角瓶中，加入相应体积的tbe或Tae缓冲液,浓度为1%-1.5%，在微波炉中加热三角瓶中，直至琼脂糖溶解。胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾干；②将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。在距离底板上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。③将温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5〜1Xtae（tris-乙酸）或tbe（tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用，没过胶面1mm以上。试剂盒回收的DNA片段（编号：clonesop-3）以本实验室常用dna凝胶回收试剂盒（天根）为例使用前请在清洗液PW中加入无水乙醇。请参考瓶子上的标签了解容量。柱平衡步骤：向吸附柱ca2中（吸附柱放入收集管中）加入500Ul平衡液bl,12,000rpm（~13,400Xg）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）（2）将琼脂糖凝胶中的单用途DNA条（尽可能去除多余部分）切入干净的离心管中,并称重。向胶块中加入等倍体积溶液pn（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100^1,则加入1OOulpn溶液），60°C水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。注：对于回收率小于300BP的小碎片，可在加入PN完全溶胶后加入1/2体积的异丙醇，以提高回收率；橡胶块完全溶解后，最好将溶液温度降至室温，然后将其置于柱上，因为吸附柱在室温下具有很强的结合DNA的能力。将上一步所得溶液加入一个吸附柱ca2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12,000rpm（~13,400Xg）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱ca2放入收集管中。⑤向吸附柱ca2中加入600卩1漂洗液pw（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400Xg）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱ca2放入收集管中。⑥重复操作步骤⑤。将吸附柱Ca2以12000rpm（~13400Xg）的转速放入回收集管中，离心2min，并尽可能去除冲洗液。吸附柱Ca2在室温下放置几分钟，并彻底干燥，以防止残留的冲洗液影响下一次实验。将吸附柱ca2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液eb或ddh2o，室温放置2min°12,000rpm（~13,400Xg）离心2min收集dna溶液。酶消化反应（编号clonesop-4）以本实验室常用酶fastdigestrestrietionenzymes（thermo）为例双酶切体系（若是单酶切则只用加一种酶）：十分钟？bufferor10Xfastdigest?绿色缓冲5硫酸消化限制酶10。5T快速消化限制酶20。5Tu1dnanddh2oupto50ul酶消化系统搅拌均匀后，在37C下反应，反应时间应大于30min。如果载体（2-3ug）为酶消化，则至少应为2H。5•酶切产物的回收（编号clonesop-5）我们实验室常用的Axygen?axyprep?以pcrcleanupkit(axygen)为例在pcr、酶切、酶标、或测序反应液中，加入3个体积的bufferpcr-a（若bufferpcr-a如果小于lOOul,则添加至lOOul），混合均匀，转移至制备管中，将制备管放入2ml离心管中，离心12000g，离心1min，并丢弃滤液。将制备管置回2ml离心管，加700ulbufferw2,12000g离心1min，弃滤液。③将制备管置回2ml离心管，加400ulbufferw2,12000g离心1min，弃滤液。将制备管放回2ml离心管中，离心12000g，离心1min。将制备管放入清洁的1.5ml离心管中，静置2min。在制备管中央加25-30uleluent或ddh2o，室温静置1min，12000g离心1min洗脱dna。重组反应（编号clonesop-6）以本实验室常用novorec?pcr—步定向克隆试剂盒（novoprotein）为例体系：10X1Novorec?重组酶0.5ul线性化载体n插入片段nddh20高达10ul注：载体与目的片段的摩尔比在1:3-1:10之间复合反应充分混合后，将其置于37°C水浴中20至30分钟，然后取出并置于冰上立即转化转化（编号clonesop-7）①将大肠杆菌的活性细胞从-80C冰箱中取出，迅速放在冰上，慢慢解冻并重新包装。②取出连接产品，加入分装接收状态，在冰上孵育25分钟42C热激90sec，置于冰上孵育2min，加入700ul，不含抗生素的lb培养基，180rpm37C培养45min。以3000rpm离心1min，丢弃大部分上清液，留约50T00ul，重新悬浮沉淀物，将其滴在已添加玻璃珠的LB板（具有相应阻力）上，并均匀涂抹玻璃珠。⑤倒出玻璃珠，将LB板置于37C培养箱中过夜培养。挑克隆摇菌与菌落pcr检测阳性克隆（编号clonesop-8）①从37C培养箱中取出培养过夜的平板，用镊子高压灭菌后小心取出枪头，用枪头尖端轻轻触摸单个克隆，然后将枪头尖端在一个1.5mlep的管中搅拌几次，该管中含有150ullb液体（具有相应的阻力）和菌落PCR反应系统。将带有培养基的EP管在37°C220rpm下培养3小时。②菌落PCR：20ul菌落per体系，以本实验室常用2Xtsingkemastermix为例：2X10ul的混合物。5ulprimer20。5ul细菌ddh2o9ul菌落PCR程序：95C3min95C30s58C30S30循环72C1-2kb/min72C5min12C^③琼脂糖电泳检测per产物以判定阳性克隆9•细菌溶液的扩大培养（编号：clonesop-9）将per鉴定为阳性的菌液吸取5-10ul接种至5mllb（含抗性）培养基中，在220rpm,37C摇床中过夜培养。10.小提取质粒（编号：elonesop-10）取出过夜培养的菌液，对已经混浊的菌液进行质粒提取（天根质粒dna小提试剂盒）。柱平衡步骤：向吸附柱ep3中（吸附柱放入收集管中）加入500Ul的平衡液bl,12,000rpm（~13,400Xg）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。取5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，4500rpm离心5分钟，尽量吸除上清，将菌体沉淀收集到一个离心管中。向离心管中加入200UL细菌沉淀溶液P1（已提前加入RNaseA），并使用移液管或旋涡振荡器完全悬浮细菌沉淀。向离心管中加入200ul溶液p2,温和地上下翻转6—8次使菌体充分裂解。向离心管中加入300UL溶液P3，立即轻轻上下转动6e8次，搅拌均匀。此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm（~13400Xg）离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。注意：p3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色可再次离心后取上清。用移液管将上一步收集的上清液转移到吸附柱CP3（吸附柱放入收集管），注意不要尽可能多地吸出沉淀物。12000rpm（~13400Xg）离心30-60秒，将收集管中的废液倒出，将吸附柱CP3放入收集管中。向吸附柱cp3中加入600^1漂洗液pw（事先已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400Xg）离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。⑧向吸附柱cp3中加入600卩1漂洗液pw,12,000rpm（~13,400Xg）离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。将吸附柱CP3以12000rpm（~13400Xg）的转速放入收集管中离心2分钟，以去除吸附柱中残留的冲洗液。将吸附柱cp3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加80U1洗脱缓冲液eb,室温放置2分钟，12,000rpm（~13,400Xg）离心1分钟将质粒溶液收集到离心管中。置于4°C备用。三、实验中的注意事项pcr实验请注意酶的扩增效率，有的酶是1kb/min,有的是2kb/min,具体请查看相应酶的说明舒。琼脂糖凝胶制备过程中请注意污染区与非污染区，在电泳点样前请确保样品和dnamarker添加了核酸染料。试剂盒使用之前检查漂洗液是否已加入无水乙醇。四、常用培养基和缓冲液的制备：1.1b液体培养基（11）配方：10g胰蛋白胨5g酵母提取物5g氯化钠用去离子水定容至11，高压蒸汽灭菌20分钟。2.1b液体培养基（11）配方：10g胰蛋白胨5g酵母提取物5g氯化钠15g琼脂粉用去离子水定容至1L，用高压蒸汽消毒20分钟。3.TB液体介质（1L）配方：将下列组分溶解在0.91水中：蛋白胨12g,酵母提取物24g，甘油4m1。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60C，再加100m1灭菌的170mmo1/1kh2po4/0.72mo1/1k2hpo4的溶液（2.31g的kh2po4和12.54gk2hpo