木薯抗细菌性枯萎病鉴定接种细菌悬浮液接种方法的比较

木薯抗细菌性枯萎病鉴定接种细菌悬浮液接种方法的比较

甘薯是一种耐旱、易稀释的冬末谷物。与甘薯和甘薯一起被称为三种谷物。这是亚热带和亚热带农民的重要食物和经济收入来源之一。木薯细菌性枯萎病(病原菌:Xanthomonasaxonopodispv.manihotisVauterin,Kerters&Swings)是国内检疫对象,该病最初报道在巴西发生,后蔓延至南美洲、非洲及亚洲部分国家。染病木薯危害严重,而化学防治难以奏效,病田一般减产30%～50%,严重时可绝收。该病菌随种茎、薯干及种子等材料的调运进行远距离传播,具有带菌未显病症的特点,病株组织含菌量小于3×102～104cfu/mL时,PCR扩增检测不到特征性谱带。传统的植物检疫手段存在局限性。随着我国加入WTO并与疫区国家进行木薯产品的交流,木薯细菌性枯萎病在我国扩散危害的形势十分严峻,如对该病控制不力,将对我国木薯生产构成严重威胁。我国木薯研究始于20世纪50年代,但工作多集中在品种资源的收集和保存、品种选育与推广、高产栽培技术及深加工技术等方面。种植抗病品种是防治植物病害流行的经济有效的措施,但目前国内尚未见到对木薯细菌性枯萎病抗性鉴定技术研究的报道。因此,对木薯细菌性枯萎病进行抗源筛选、评价和利用缺乏依据,制约了抗病育种工作的开展。为了探讨木薯细菌性枯萎病抗性鉴定技术及其在抗病育种上的应用前景,本试验于2007～2008年在隔离的玻璃网室内,对木薯细菌性枯萎病抗性测定方法进行了研究,以期为我国木薯抗病品种选育工作的开展提供技术支撑。1材料和方法1.1供试菌株鉴定以木薯细菌性枯萎病菌BH-1菌株为供试菌株。该菌株是从病害样本(广西植保总站植物检疫站提供)分离获得,经柯氏法则测定致病性后在-30℃下保存。1.2试验结果表明，甘薯品种供试木薯品种为GR911(广西农业科学院经济作物研究所提供)。1.3试验内容和方法1.3.1细菌悬浮液的制备和接种将病菌在牛肉膏蛋白胨培养基(蛋白胨5g、牛肉膏3g、酵母膏1g、蔗糖10g、琼脂17g、蒸馏水1000mL)上培养48h,再用无菌水配制成108cfu/mL细菌悬浮液备用。在木薯生育前期分别采用以下几种方法进行接种:①刷叶法,用无菌牙刷蘸1次细菌悬浮液后轻刷1次小叶;②压伤滴菌法,无菌胶头滴管先吸取细菌悬浮液,再用滴管口轻压小叶,使其形成微伤口,然后用手挤胶头,滴一滴细菌悬浮液在微伤口上;③剪叶法,用无菌剪刀蘸1次细菌悬浮液后剪1张小叶,剪去叶尖的叶面积约占整张叶片面积的1/10;④普通针刺法,把针距为1.0cm×1.0cm的6根大头针固定在橡皮上灭菌后,将其蘸1次细菌悬浮液后刺伤1张小叶;⑤伤根淋菌法,先对木薯根部进行翻耕伤根,然后用3×107cfu/mL细菌悬浮液淋根,每株淋1L,设3个重复,每个重复淋5株木薯;⑥喷雾法,用手提式喷雾器对木薯叶片均匀喷施细菌悬浮液,设3个重复,每个重复喷雾接种5株木薯,保湿2d,第10天后调查记载病情;⑦改良针刺法,把针距为1.0cm×1.0cm的4根大头针固定在橡皮上灭菌备用。用直径为9cm的无菌海绵吸足细菌悬浮液后置于培养皿内,在海绵上叠4～8张小叶,用带橡皮的大头针刺一下后,再将橡皮挤压一下海绵至挤出菌液再拔出,每个重复刺5株木薯叶片,每株接种3～5次,第10天后调查记载病情,设3个重复,接种过程注意给海绵补充细菌悬浮液(下同)。以上的刷叶法、压伤滴菌法、剪叶法、普通针刺法均设3个重复,每个重复接种5株木薯叶片,每株接种3～5张复叶,每张复叶接种4～7张小叶,接种后第10天调查记载病情。1.3.2针孔发病率调查将病菌用无菌水配成浓度为3×109cfu/mL的细菌悬浮液,逐级稀释10倍,分别配制成3×108cfu/mL、3×107cfu/mL、3×106cfu/mL、3×105cfu/mL、3×104cfu/mL、3×103cfu/mL、3×102cfu/mL共8个浓度梯度后,在木薯生育前期用改良针刺法接种,分别在接种后第4天、第6天、第8天、第10天调查记载针孔发病率,第10天调查记载病情级别。1.3.3调查记录及衔接在木薯生育前期分别对木薯叶片、茎秆、根部进行接种:对叶片用改良针刺法进行接种,接种后第10天、第15天分别调查记载病情级别;对茎秆用无菌解剖刀斜切皮部后再向下纵剖1～2cm,然后将带菌棉团夹于斜切伤口部位,接种后分别在第15天、第30天分批测量茎秆病部褐变组织长度;对根部进行深翻伤根,然后每株用1L细菌悬浮液(3×106cfu/mL)淋根,接种后分别在第30天、第60天调查记载病情。1.3.4根据病斑长度分级标准分为5级和9级对于接种伤口较小的普通针刺法、改良针刺法均采用以下分级标准记载病情:0级为针孔无症状;1级为病斑长度小于0.5cm;3级为病斑长度0.6～1.5cm;5级为病斑长度1.6～2.5cm;7级为病斑长度2.6～4.0cm;9级为病斑长度大于4.0cm。而对于接种伤口较大的刷叶法、压伤滴菌法、剪叶法及无伤接种的喷雾法、伤根淋菌法均采用以下分级标准记载病情:0级为叶片无病斑;1级为病斑占叶面积1/10以下;3级为病斑占叶面积1/10～1/4;5级为病斑占叶面积1/4～1/2;7级为病斑占叶面积1/2～3/4;9级为病斑占叶面积3/4以上。2结果与分析2.1接种后病情变幅不同接种方法的抗性鉴定结果见表1,采用喷雾法、伤根淋菌法接种不发病,其他接种方法接种后均发病,而且病叶率均较高(93.2%以上)。刷叶法、压伤滴菌法、剪叶法3种方法接种后病情变幅较大,病指在3～9级。普通针刺法与改良针刺法接种后潜伏期为5～6d,病叶率较高(98.6%以上),病情变幅较小,病指在7～9级,较为稳定。工作量以剪叶法与改良针刺法相对较少。2.2接种细菌悬浮液浓度试验结果见表2,当接种细菌悬浮液浓度为3×102cfu/mL时,接种后第10～30天未观察到病状;接种细菌悬浮液浓度达3×103cfu/mL时,接种后第8～10天观察到针孔发病;当接种细菌悬浮液浓度为3×107～3×108cfu/mL时,针孔发病率高,病情稳定,接种后同一品种病株之间的病情级别变幅不大;当接种细菌悬浮液浓度达3×109cfu/mL时,病情级别均为9级;当接种细菌悬浮液浓度低于3×106cfu/mL时,同一品种病株之间的病情级别在0～9级。2.3髓部褐变组织生长情况植株不同部位的接种结果见表3,用改良针刺法对叶片进行接种,发病充分,两年的病情结果稳定。在木薯茎秆中上部斜切接种带菌棉团,植株髓部褐变组织长度两年的结果差异较大。采用菌液淋根法接种,两年的结果一致,接种后第30～60天没有观察到植株叶片、茎秆髓部和根块发病。3抗性鉴定方法的选择当接种细菌悬浮液浓度达3×109cfu/mL时,植株发病快而且病情级别偏高,供试品种均表现为高感,而当接种细菌悬浮液浓度低于3×106cfu/mL时,植株发病慢且病情级别变幅较大,两者均难以区分品种的抗感反应。可初步认为接种细菌悬浮液适宜浓度为3×107～3×108cfu/mL;改良针刺法和剪叶法由于工作量相对较少,对大批量品种进行抗性鉴定初筛宜采用改良针刺法或剪叶法,而复筛和抗性稳定性测定再用普通针刺法进行筛选,其他接种方法因在同一品种上的病级变幅较大,难以表现品种的抗感性;接种的部位以叶片为宜,不仅发病充分,便于调查记载,而且两年的试验结果病情级别变幅不大,重复性好。对木薯细菌性枯萎病进行抗性鉴