蔗糖密度梯度离心法和差速离心法提取的脐带间充质干细胞来源外体的比较

蔗糖密度梯度离心法和差速离心法提取的脐带间充质干细胞来源外体的比较

间充质干细胞（msc）的存在对损伤恢复的影响日益受到关注。本课题组的前期研究表明,人脐带间充质干细胞来源的外体(hucMSC-Ex)能修复四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化以及顺铂诱导的急性肾损伤,但究竟何种蛋白质成分起关键作用尚不清楚。近年来,用质谱法对外体进行蛋白质组学分析的技术已得到飞速发展,为了得到准确、可靠的结果,要求样品必须有较高的纯度和浓度。研究表明,许多高丰度蛋白质的存在必然会干扰一些功能性小分子蛋白质的分离和鉴定,因此,通过改进提取方法以获得更纯的hucMSC-Ex具有重要意义。本研究主要对常用的蔗糖密度梯度离心联合超滤超速离心法(以下简称蔗糖密度梯度离心法)和差速离心法提取的hucMSC-Ex进行比较,旨在为hucMSC-Ex的基础与临床应用提供实验依据。1材料和方法1.1免疫、定量分析试剂人脐静脉内皮细胞(EA.hy926)购自中国科学院细胞库;低糖DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司),无血清培养基(上海依科赛公司),重水(D2O,上海创赛公司),分析纯蔗糖(广州化学试剂厂),兔抗人CD9抗体(美国BioworldTechnology公司),兔抗人CD81抗体(美国Epitomics公司),BCA蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗(北京康为世纪公司),预混HRP化学发光底物、100-kDaMWCO超滤离心管、0.22μm无菌滤膜(美国Millipore公司),氯甲基苯甲酰氨荧光染料(CM-DiI,美国MolecularProbes公司),hoechst33342染料(美国Sigma公司);超速冷冻离心机(OptimaL-90K,美国BeckmanCoulter公司),透射电子显微镜(FEITecnai12,Philips公司),全自动凝胶成像仪(北京赛智公司),二氧化碳培养箱、高内涵分析仪(美国ThermoScientific公司)。1.2hummc的分离和训练采用本实验室已建立的方法分离培养及鉴定hucMSC,分离出的hucMSC于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。1.3外体分离和外体分离选择生长状态良好的3~5代hucMSC用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养,待细胞融合至70%~80%时换无血清培养基培养,48h后收集培养上清液,300×g离心10min以去除漂浮的活细胞,用于外体的分离。1.4hummc-ex分离1.4.1蔗糖/重水质糖液的浓缩参照Zhu等的方法并加以改进。将收集的hucMSC上清液于4℃、2000×g离心10min,以去除细胞碎片;收集上清后于4℃、10000×g离心30min,以去除细胞器;将上清液转移至100-kDaMWCO超滤离心管,4℃、1000×g离心30min进行浓缩;将浓缩液缓慢移至5mL30%蔗糖/重水密度垫(ρ=1.210g/cm3),4℃、100000×g离心3h;收集底部5mL蔗糖/重水层(含外体),用PBS稀释后加入100-kDaMWCO超滤离心管中,4℃、1000×g离心30min,PBS洗涤3次;最后用0.22μm无菌滤膜过滤除菌,分装后于-70℃保存,并用BCA蛋白质定量试剂盒进行蛋白质定量检测。1.4.2离心液的制备参照Clotilde等方法,将收集的hucMSC上清液于4℃、2000×g离心10min,以去除细胞碎片;收集上清液后于4℃、10000×g离心30min,以去除细胞器;将上清液用0.22μm无菌滤膜过滤除菌后直接置4℃、100000×g离心3h;弃上清液,沉淀用无菌PBS重悬后,置4℃、100000×g离心3h;弃上清液,沉淀用无菌PBS重悬,分装后于-70℃保存,并用BCA蛋白质定量试剂盒进行蛋白质定量检测。1.5铜网透射电镜sem观察取上述两种方法提取的hucMSC-Ex各20μL,充分混匀后滴加于直径2mm的载样铜网上,于室温静置5min后,用滤纸轻轻吸去铜网边缘残余液体,然后将铜网倒扣于30g/L磷钨酸(pH6.8)液滴上,室温下负染5min,最后将铜网在白炽灯下烘干,置于透射电镜下观察并拍照。1.6s-东南角电泳将上述两种方法提取的hucMSC-Ex用15%SDS电泳(80V,90min)分离,取出分离胶,用2.5g/L考马斯亮蓝R-250染色,沸水快速脱色后经全自动凝胶成像仪扫描图像并分析。1.7免疫兔抗人cd9和cd81的表达配制15%SDS电泳胶,将上述两种方法提取的hucMSC-Ex充分裂解后加入1/4体积的5×SDS上样缓冲液,煮沸5min,按200μg蛋白质总量上样,将蛋白质电转印(350mA,120min)至PVDF膜上,用含50g/L脱脂牛奶的TBS/0.5%Tween20室温封闭1h,分别与兔抗人CD9抗体(1∶500稀释)和兔抗人CD81抗体(1∶500稀释)于4℃反应过夜,次日用TBS/0.5%Tween20洗膜3次后,与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗37℃温育1h,TBS/0.5%Tween20洗膜3次后,加入预混HRP化学发光底物,并用ECL化学发光系统进行检测。1.8细胞表型的制备用亲脂性红色荧光染料CM-DiI按5μL/mL的比例加入上述两种方法提取的hucMSC-Ex中,充分混匀后于37℃避光温育30min,然后转移至100-kDaMWCO超滤离心管,并加入10倍体积的PBS,4℃、1000×g离心30min以洗去未与hucMSC-Ex结合的染料,最终将浓缩液分别加入脐静脉内皮细胞EA.hy926中,37℃温育4h后,PBS洗涤2次,再用4%多聚甲醛固定细胞20min,hoechst33342(1∶200稀释)染细胞核10min,高内涵分析仪上观察并拍照。2结果2.1膜性囊泡结构透射电镜下可见两种方法提取的hucMSC-Ex均具有典型的圆形或椭圆形的膜性囊泡结构,直径约为30~100nm,腔内为低电子密度成分(图1)。2.2差速离心法分离细胞外解蛋白的检测SDS和westernblot检测结果显示,两种方法提取的hucMSC-Ex内均含有多种蛋白质成分,并且均表达外体的标志蛋白CD9和CD81(图2A),而差速离心法中经2000×g处理的沉淀(即细胞碎片)和100000×g处理的上清液(去除外体成分)均未检测出外体的标志蛋白(图2B)。相同浓度条件下,差速离心法提取的hucMSC-Ex其表面标志比蔗糖密度梯度离心法表达更强,但高丰度蛋白质(Mr:55000~70000)含量却明显低于蔗糖密度梯度离心法(图2A),从图2B中可见100000×g处理的上清液中含有大量高丰度蛋白质,可以推测这些高丰度蛋白质主要来源于无血清培养基的污染。2.3标记和内部控制3不同分离方法的比较外体是一种由胞内多胞体(multivebodies,MVB)与胞膜融合后分泌到细胞外环境中的膜性小囊泡,其主要特征有:(1)直径约30~100nm;(2)密度为1.13~1.19g/cm3;(3)具有来源细胞胞质、胞膜成分以及外体相关标志性蛋白,如CD9、CD81等,在细胞与细胞间通讯中起到非常重要的作用。研究表明,MSC来源的外体能有效改善心肌缺血/再灌注损伤以及急、慢性肾损伤和肝纤维化。因此,有望成为一种新的非细胞成分用于组织损伤的修复。蛋白质组学分析发现外体的蛋白质组成比较复杂,且不同细胞来源的外体其蛋白质组成亦有较大差异,这赋予了外体复杂的生物学功能。在蛋白质组学分析中,高丰度蛋白质的存在会掩盖很多功能性小分子蛋白质的检出,对实验结果的准确性造成严重干扰,所以,我们的样品必须符合纯度高、高丰度蛋白质含量尽可能少的标准,此外,还要考虑操作简便,成本低廉等实际因素。因此,寻找符合上述条件的提取外体的方法非常重要。目前,去除高丰度蛋白质的方法主要有免疫亲和层析法、有机溶剂沉淀法和超滤离心法等。免疫亲和层析法的去除专一性强、去除效率高,一次可以去除多种高丰度蛋白质,但该方法成本较高,且操作繁琐;有机溶剂沉淀法虽然成本低廉、操作简单,但是有机溶剂在沉淀高丰度蛋白质的同时会将部分低丰度蛋白质一同沉淀下来,因此特异性不高;超滤离心法可根据高丰度蛋白质的分子量选择合适的MWCO超滤膜,并借助离心力作用有效去除高丰度蛋白质,但是该法在截留高丰度蛋白质的同时还会截留某些分子量大于高丰度蛋白质的功能性蛋白质。由此观之,以上方法在去除高丰度蛋白质的同时都或多或少导致部分功能性低丰度蛋白质的丢失,都不适用于外体中高丰度蛋白质的去除。外体是活细胞分泌的一种多因子复合体,研究表明,超高速(100000×g)离心能够有效的将外体分离沉淀,利用外体的这一特点可以将其与培养上清液中其他可溶性蛋白质有效地分离,因此,比较外体不同提取方法具有重要意义。本研究中,我们分别用蔗糖密度梯度离心法和差速离心法成功提取了hucMSC-Ex,发现在相同蛋白质浓度下,差速离心法提取的hucMSC-Ex其表面标志物的表达量明显强于蔗糖密度梯度离心法,相同时间内外体进入靶细胞的数量也明显多于蔗糖密度梯度离心法,但高丰度蛋白质含量却大大降低,说明差速离心法提取的hucMSC-Ex较蔗糖密度梯度离心法更纯,相同作用时间内前者在靶细胞中发挥的生物学效应也有可能更强,因此,在进行功能实验时差速离心法提取的hucMSC-Ex的作用效果更具有代表性。综上所述,差速离心法既能最大限度地去除不需要研究的高丰度蛋白质,同时又不影响外体的生物学活性及其包含的功能性低丰度蛋白质的含量,且操作简便、成本低廉、重复性好,不仅可以满