大蒜素和枸杞多糖对草鱼血清酶活性的影响

大蒜素和枸杞多糖对草鱼血清酶活性的影响

大蒜是大蒜的主要生物活性成分，包括各种丙烯基有机物质。研究表明,大蒜素有多种生物学功能,具有抗菌、降低胆固醇、抗血小板聚集、护肝、预防心血管疾病和降低血压等生理学作用;枸杞多糖(1yciumbarbarumpo1ysaccharidesLBP)是枸杞子中主要免疫活性成分,具有调节免疫、清除自由基、抑制肿瘤、延缓衰老、降血脂、降血糖和抗疲劳等作用。目前,国内学者对大蒜素和枸杞多糖在水产动物上的应用已有报道。王常安等研究了大蒜素对哲罗鲑血液非特异免疫因子的影响;王远吉就枸杞多糖对鲫鱼血清溶菌酶活性的影响进行了研究和报道。而关于大蒜素和枸杞多糖以饲料添加剂形式用于草鱼抗病性的研究报道甚少。鱼类的非特异免疫抵抗,包括溶菌酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、丙二醛、补体C3等非特异免疫体液因子及巨噬细胞和单核细胞的吞噬等,对于鱼类抵抗病原的侵袭和感染具有重要的作用。本研究通过在草鱼饲料中分别添加上述两种添加剂,经过一段时间饲喂后,测定其血清溶菌酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、丙二醛、补体C3和白细胞吞噬率六个免疫指标,评价两种添加剂对草鱼非特异性免疫功能的影响,以期为草鱼抗病性添加剂的开发和应用提供参考资料。1材料和方法1.1组a0b3在基础饲料(表1)中分别添加不同浓度的大蒜素0.4%(A1组)、0.8%(A2组),枸杞多糖0.066%(A3组)、0.132%(A4组)两种添加剂(表2),未添加组(基础饲料组)为对照组(A0组)。共4个试验组,一个对照组,每组设两个平行。饲料配制时,所添加的免疫增强剂以等量减少麦麸用量保持配方平衡。1.2试验分组与投喂试验草鱼购自辽宁省辽阳市佟二堡东荒农场,体重(108±5)g,暂养15d,期间投喂基础饲料。将健康的草鱼随机分为5组,即一个对照组(A0)和A1、A2、A3、A4共5个试验组,每组设两个平行。将试验鱼饲养在1.0m×0.5m×1.0m的网箱内,每箱25尾,分别投喂相应饲料,日夜充氧。每天投喂3次(8:00-9:00、13:00-14:00、18:00-19:00),投饵量为鱼体重的4%,每7d调整一次投饵量,每天排污一次。试验从2010年7月下旬至9月上旬,共42d,试验期间水温(25±2)℃,pH(7.0±0.2),DO≥5mg/L,NH3-N<0.3mg/L。每天观察并记录试验鱼的摄食及活动情况。1.3指标和方法的测量1.3.1血清中c7活性的测定在试验的14d,28d,35d,42d,从各组中随机抽取3条鱼,尾静脉抽血,于4℃条件下3000r/min离心10min,收集上部血清,在4℃冰箱中保存,供溶菌酶、碱性磷酸酶、丙二醛、超氧化物歧化酶活性和补体C3活性的测定用。1.3.2抗氧化酶活性测定溶菌酶活性测定采用比浊法;碱性磷酸酶活性测定采用对硝基苯磷酸盐法;丙二醛采用硫代巴比妥酸法(TBA);超氧化物歧化酶活性测定采用黄嘌呤氧化酶法;补体C3采用免疫比色法;上述5种指标测定均使用南京建成生物技术研究所的试剂盒。1.3.3感染活性的测定于试验的35d,从各箱中随机抽取一条草鱼,采血管和注射器先用1%肝素抗凝剂润洗一下,于尾静脉采血0.5mL,加入新制备的过夜培养的嗜水气单胞菌悬液(由黑龙江水产研究所惠赠)0.2mL,菌液浓度为1×108cfu/mL.混匀,37℃水浴孵育30min,并于孵育过程前20min,每隔5min轻轻振荡一次,共4次,后10min静置。孵育结束后用毛细管从红细胞层表面吸取上清少许推片。自然干燥后滴加甲醇固定3min,蒸馏水冲洗,瑞士染液染色1min,蒸馏水冲洗,晾干,油镜镜检。以吞噬百分比计算吞噬活性。吞噬百分比=(100个吞噬细胞中参与吞噬的细胞数/100)×100%。1.4数据分析和处理试验结果用“平均值±标准差”表示,采用SPSS13.0在a=0.05水平下进行统计分析,数据经方差分析后进行组间两两(LSD)比较。2结果与分析2.1不同枸杞多糖添加量对导致保肝作用的影响由表1数据可知,添加大蒜素的草鱼血清溶菌酶活性除第14d外,均随着添加大蒜素量的增加而升高,但没有显著差异(P>0.05)。添加枸杞多糖的草鱼血清溶菌酶活性均随着添加枸杞多糖量的增加而升高,第28d时,A4组的草鱼血清溶菌酶活性显著升高(P<0.05)。与对照组比较,A1、A2、A3和A4组的草鱼血清溶菌酶活性在第28d时均有所升高。其中,A1、A2和A4组的草鱼血清溶菌酶活性均在28d时显著升高(P<0.05),并达到最大值,分别达到0.033±0.008、0.045±0.006、0.044±0.011。2.2小鼠血清中抗菌药活性的比较由表2数据可知,添加大蒜素的草鱼血清碱性磷酸酶活性均随着添加大蒜素量的增加而降低,但没有显著差异(P>0.05)。添加枸杞多糖的草鱼血清碱性磷酸酶活性均随着添加枸杞多糖量的增加而升高,但没有显著差异(P>0.05)。与对照组比较,A1、A2、A3、A4组的草鱼血清碱性磷酸酶活性均有所升高,A1组的草鱼血清碱性磷酸酶活性在第28d、35d时显著升高(P<0.05)。其中,A1和A2组的草鱼血清碱性磷酸酶活性分别在35d、28d时达到最大值,分别达到81.487±24.553、66.961±38.997;A3和A4组的草鱼血清碱性磷酸酶活性在35d时达到最大值,分别达到58.40±22.994、64.923±18.959。2.3不同处理对枸杞多糖量的影响由表3数据可知,添加大蒜素的草鱼血清超氧化物岐化酶活性均随着添加大蒜素量的增加而升高,但没有显著差异(P>0.05)。添加枸杞多糖的草鱼血清超氧化物岐化酶活性均随着添加枸杞多糖量的增加而升高,但没有显著差异(P>0.05)。与对照组比较,除第14d、42d外,A1、A2、A3、A4组的草鱼血清超氧化物岐化酶活性均有所升高;A3、A4组的草鱼血清超氧化物岐化酶活性在第35d时显著升高(P<0.05)。其中,A1和A2组的草鱼血清超氧化物岐化酶活性在28d时达到最大值,分别达到100.351±4.283、109.901±7.152;A3和A4组的草鱼血清超氧化物岐化酶活性在35d时达到最大值,分别达到115.663±4.142、117.761±7.294。2.4不同处理对咸鱼血清二醛活性的影响由表4数据可知,添加大蒜素的草鱼血清丙二醛含量均随着添加大蒜素量的增加而升高,但没有显著差异(P>0.05)。添加枸杞多糖的草鱼血清丙二醛含量随着添加枸杞多糖量的增加而升高,但没有显著差异(P>0.05)。与对照组比较,A1、A2、A3、A4组的草鱼血清丙二醛活性均有所降低,但没有显著差异(P>0.05);其中,A1和A2组的草鱼血清丙二醛含量在28d时达到最小值,分别达到9.552±0.853、8.000±1.523;A3和A4组的草鱼血清丙二醛含量在35d时达到最小值,分别达到6.202±0.667、6.873±0.974。2.5不同浓度枸杞多糖对金枪鱼血清补体c3活性的影响由表5数据可知,添加大蒜素的草鱼血清补体C3活性均随着添加大蒜素量的增加而降低,35d时,A2组的草鱼血清补体C3活性显著降低(P<0.05)。添加枸杞多糖的草鱼血清补体C3活性均随着添加枸杞多糖量的增加而升高,但没有显著差异(P>0.05)。与对照组比较,A1、A2、A3、A4组的草鱼血清补体C3活性均有所升高;A1组的草鱼血清补体C3活性在第35d时显著升高(P<0.05)。A3组的草鱼血清补体C3活性在第28d时显著升高(P<0.05)。A4组的草鱼血清补体C3活性在第28d、35d时显著升高(P<0.05)。其中,A1、A2、A3、A4组的草鱼血清补体C3活性在35d时达到最大值,分别达到0.7102±0.234、0.4385±0.238、0.5627±0.037、0.7185±0.0957。2.6大蒜素对金枪鱼血液管质中正反应的活性的影响35d持续投喂不同剂量添加剂对草鱼血液白细胞吞噬活性影响的统计结果见图1。由图1可知,与对照组相比,A1、A2、A3、A4组草鱼血液白细胞吞噬活性均有所升高;A1、A2组草鱼血液白细胞吞噬率显著提高(P<0.05),A1组草鱼血液白细胞吞噬率活性最高,达到34.68±6.63。添加大蒜素的草鱼血液白细胞吞噬活性均随着添加大蒜素量的增加而降低,但没有显著差异(P>0.05);添加枸杞多糖(LBP)的草鱼血液白细胞吞噬活性均随着添加枸杞多糖(LBP)量的增加而升高,但没有显著差异(P>0.05)。3其他常见水产养殖技术近几年来,大蒜素、枸杞多糖作为饵料添加剂,具有天然的抗菌物质,有着和抗生素相似的作用效果,且无抗生素的药物残留等副作用,因而广泛应用于水产养殖中。如高红梅,王明学阐述了大蒜素在水产健康养殖中的应用;蔡春芳等在银鲫饲料中添加0.5%大蒜素时,表现出显著的免疫增强作用;王远吉在鲫鱼饲料中添加45mg/kg的枸杞多糖时,鲫鱼血清的溶菌酶活力效果最好。而本实验以草鱼血清溶菌酶、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶、丙二醛、补体C3和白细胞吞噬率为指标来评价大蒜素、枸杞多糖对草鱼非特异性免疫的影响。3.1不同剂量大蒜素、枸杞多糖对咸鱼血清溶菌酶活性的影响溶菌酶是评价非特异性免疫的重要指标,广泛存在于鱼类体表黏液、鳃、血清、肠胃分泌液及吞噬细胞的溶酶体颗粒中。溶菌酶能水解细胞壁中的黏肽的乙酰氨基多糖并使之裂解被释放出来,从而破坏和消除侵入体内的异物,实现机体防御的功能。曹丹等在暗纹东方纯的饲料中添加100mg/kg的大蒜素,极显著地提高暗纹东方纯脾脏中溶菌酶的活力。王远吉在鲫鱼饲料中添加45mg/kg的枸杞多糖时,鲫鱼血清的溶菌酶活力效果最好。本实验中,在第28d、35d、42d,不同添加剂试验组草鱼血清溶菌酶活性均随剂量的增大而升高;这表明不同剂量的大蒜素、枸杞多糖在饲喂相同天数后对草鱼血清溶菌酶活性的影响不同,饲喂高剂量大蒜素、枸杞多糖的草鱼血清溶菌酶活性活力好于低剂量大蒜素、枸杞多糖的草鱼血清溶菌酶活性。与对照组比较,各试验组的草鱼血清溶菌酶活性在第28d时均有所升高;其中,A1、A2和A4组的草鱼血清溶菌酶活性在第28d时显著升高(P<0.05),并达到峰值。可见,不同剂量的大蒜素、枸杞多糖在经过一段时间饲喂后能提高草鱼血清溶菌酶活性,并在一定时间范围内达到酶活力最高峰,增强草鱼的非特异性免疫力,从而提高草鱼的抗病力。这可能与大蒜、枸杞多糖可激活单核细胞的分泌水平,活化巨噬细胞,提高免疫酶活性、改变血液细胞因子含量有关。3.2对鱼类血清碱性磷酸酶活力的影响碱性磷酸酶是生物体内的一种重要的代谢调控酶,直接参与磷酸基团的转移和钙磷代谢,也能通过改变病原体的表面结构而增强被侵袭机体对病原体的识别和吞噬能力,有助于鱼体抗病力的高。李婵等在虹鳟饲料中添加15mg/kg的大蒜素,显著提高了肾脏中碱性磷酸酶的活力。黄培池,王娟研究表明连续灌胃200mg/kg枸杞多糖可显著提高小鼠的血清碱性磷酸酶活力;而枸杞多糖添加在鱼类饲料中,其鱼类血清碱性磷酸酶活力高低尚未见报道。本试验期间,A2组的草鱼血清碱性磷酸酶活力均小于A1组草鱼血清碱性磷酸酶活力,A4组的草鱼血清碱性磷酸酶活力均大于A3组草鱼血清碱性磷酸酶活力。这表明不同剂量的大蒜、枸杞多糖在饲喂相同天数后对草鱼血清碱性磷酸酶活性的影响不同,过高剂量大蒜素可能会抑制草鱼血清碱性磷酸酶活性。其中,大蒜素低剂量组、枸杞多糖高剂量组草鱼血清碱性磷酸酶活力好于大蒜素高剂量组、枸杞多糖低剂量组草鱼血清碱性磷酸酶活性。与对照组比较,不同添加剂剂量组的草鱼血清碱性磷酸酶活性在试验期均有所升高;其中,A2组的草鱼血清碱性磷酸酶活性在28d时达到最大值;A1、A3和A4组的草鱼血清碱性磷酸酶活性在35d时达到最大值。可见,各试验组在试验期间均能提高草鱼血清碱性磷酸酶活性,并在一定时间范围内达到酶活力最高峰,从而增强草鱼的非特异性免疫力,提高草鱼的抗病力。这可能与大蒜素、枸杞多糖能激活单核细胞的分泌水平、活化巨噬细胞,提高免疫活性酶的含量,刺激机体的免疫系统有关。3.3不同剂量复合饮料对金枪鱼血清超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量的影响超氧化物歧化酶是机体清除氧自由基的重要抗氧化物酶。在正常情况下,体内抗氧化酶可以清除氧化代谢产物,而当其氧化能力下降时,过量的氧自由基与不饱和脂肪酸发生脂质化氧化,会损伤细胞膜及细胞内的大分子蛋白和核酸,对动物造成损伤。因此,抗氧化酶系统在维持机体正常代谢和功能上起着十分重要作用。丙二醛是细胞氧化代谢产物,其含量高低,反应了机体细胞受自由基攻击的程度。李婵等在虹鳟饲料中添加15mg/kg的大蒜素,显著提高了肝脏、肾脏中超氧化物歧化酶的活力,降低了丙二醛含量;梁杰等灌胃试验小鼠剂量为20mg/(kg·d)枸杞多糖,与衰老组比较,超氧化物歧化酶活力极显著增加(P<0.01),丙二醛含量极显著降低(P<0.01)。而枸杞多糖添加在鱼类饲料中,其鱼类血清超氧化物歧化酶活力与丙二醛含量高低尚未见报道。本试验期间,不同剂量添加剂试验组均随添加剂量的升高,草鱼血清超氧化物歧化酶活力与丙二醛含量也随之升高;这表明不同剂量的大蒜素、枸杞多糖在饲喂相同天数后对草鱼血清超氧化物歧化酶活力与丙二醛含量影响不同。与对照组比较,除第14d、42d外,A1、A2、A3、A4组的草鱼血清超氧化物岐化酶活性均有所升高;A1和A2组的草鱼血清超氧化物岐化酶活性在28d时达到最大值;A3、A4组的草鱼血清超氧化物岐化酶(SOD)活性在第35d时显著升高(P<0.05),并达最大值。而A1、A2、A3、A4组的草鱼血清丙二醛含量在试验期间均有所降低;其中,A1和A2组的草鱼血清丙二醛含量在28d时达到最小值;A3和A4组的草鱼血清丙二醛含量在35d时达到最小值。之所以表现上述规律,可能由于大蒜素、枸杞多糖(LBP)具有一定抗氧化能力,使机体处于某种良好的生理状态,维持机体旺盛的新陈代谢,从而促进超氧化物岐化酶的生物合成,抑制了脂质成分的过氧化程度,从而使得草鱼血清的丙二醛浓度降低。3.4多次注射-葡聚糖对大鼠血清补体c3活力的影响补体是机体抵抗微生物感染的重要成分,由存在于体液的多种具有酶活性的球蛋白组成,可以通过经典途径和旁路途径激活,在鱼类早期抗感染过程中发挥着重要作用。血清中C3是补体系统中主要成分,目前尚无大蒜素、枸杞多糖对鱼类血清补体活性影响的报道。张志勉等研究表明,服用大蒜素后,人体红细胞C3b受体花环率显著高于对照(P<0.05),淋巴细胞免疫功能接近或高于对照组。Misra等通过多次注射β-葡聚糖可显著提高罗非鱼血清补体C3的含量。本试验期间,A2组的草鱼血清补体C3活