胡萝卜幼苗愈伤组织诱导及分化的研究

胡萝卜幼苗愈伤组织诱导及分化的研究

胡萝卜是波形科的二级草本植物。它是世界上最重要的蔬菜之一，种植面积非常广泛。胡萝卜的块根营养丰富,其肉质根富含蔗糖、葡萄糖、淀粉、植物纤维、蛋白质及胡萝卜素等营养物质。近些年来,随着生物技术与分子生物学技术的快速发展,许多国家对胡萝卜体细胞的杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛的研究,从而为胡萝卜产量的提高、品质改良、抗病和抗虫力的提高提供了更大的发展空间。在国内的研究中,石琰等和杨艳梅等使用下胚轴作为外植体建立了胡萝卜组织培养高效再生体系;陈艳红等以胡萝卜无菌苗的下胚轴为外植体研究了体胚的诱导培养条件;高金秋等以无菌苗的子叶和下胚轴作外植体,对可能影响胡萝卜体细胞胚分化率的基本培养基、激素配比进行了研究;庄飞云等研究了胡萝卜小孢子胚状体和愈伤组织的诱导条件;周玲艳等以胡萝卜块根为材料诱导出愈伤组织,建立了其悬浮细胞系,并以胡萝卜直根的韧皮部、形成层、木质部为外植体建立了愈伤组织诱导和植株再生体系;陈磊等以胡萝卜的根及丛生芽为外植体,比较了不同外植体获得无性系的灭菌方法和分化增殖生根的激素配比。目前尚未见到用2个月苗龄的胡萝卜幼苗根、茎、叶为外植体进行组织培养的研究报道。在该试验中,笔者以培养约2个月的胡萝卜幼苗为材料,分别取幼苗的根、茎、叶作为外植体,研究不同培养基、不同外植体对愈伤组织诱导的影响,以及再生植株的培养条件。1材料和方法1.1材料表面1.1.1材料市售的胡萝卜“新黑田五寸人参”品种。1.1.2诱导愈伤组织培养基基本培养基、分化培养基、生根培养基均为MS0,即:MS+30g/L蔗糖+5g/L琼脂粉;诱导愈伤组织培养基有2种,分别为M1:MS0+0.1mg/L2,4-D和M2:MS0+0.5mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA。上述培养基均调节pH值至5.8,再在121℃下高压蒸汽灭菌20min。1.2制备生物小学,确定测定测定第一、2个月的方法培养的测定胡萝卜幼苗将胡萝卜种子在超净台上用75%的酒精消毒1min,再置于84消毒液与无菌水以1∶1比例配制的消毒溶液中浸泡8min,无菌水冲洗4～5次,将种子置于无菌滤纸上吸去水分,播种于不含任何激素的MS0固体培养基上,在光暗比14h∶10h、25℃条件下培养2个月得到无菌胡萝卜幼苗。1.3种愈伤组织的诱导在超净台上将胡萝卜幼苗的根、茎、叶切成大小一致的小块,分别接种于2种愈伤组织诱导培养基上,在25℃下进行暗培养,30d后统计分析愈伤组织的诱导情况,3周左右继代1次。1.4化培养基上愈伤组织的分化挑选色泽淡黄、松散、生长旺盛的愈伤组织接种于分化培养基上,于光暗比14h∶10h、25℃条件下培养约30d,诱导不定芽的产生,过程中注意观察记录数据,统计30d后愈伤组织的分化率。1.5诱导生根、诱导生根分化出的芽苗连同愈伤组织一起切下转入生根培养基中,使已分化的芽苗变得粗壮。再将长约1～2cm的芽苗切下,接种至新鲜的生根培养基上诱导生根。出愈率=(产生愈伤组织的外植体数/接种的外植体数)×100%绿苗分化率=(分化绿苗的愈伤组织块数/转移的愈伤组织块数)×100%1.6进行炼苗、炼苗和炼苗待生根植株形成一定量的根系并长至6～7片叶时,进行炼苗。炼苗约7d后开启瓶盖,在超净台上将其拔出,用无菌水轻轻冲洗除去根系上的培养基,再移入装有土的盆钵中,于温室中进行常规栽培管理。2结果与分析2.1%的不符合党员选择第20%,这4.2%,是造成每一个国家的按份共有7.2.2%,是造成每一个国家的按份共有7.2.2.2.2%,是造成每一个国家的按份共有7.2.2%,是造成每一个国家的按份共有7.2.2.2.2.2%,是造成每一个工资标准不实、70.2.2%,是造成每一个国家的党的群众都是以人民为中心的分布,是以人民生活为中心的分布,是以人民生活为中心的请求权,是造成基层党组织改变,是造成基层社会治理能力,是造成基层社会政治安全网络结构上的不稳定因素,是造成基层党组织功能不均衡的表现,是以人民生活为中心的请求权,是造成基层党组织功能不均衡的表现,是以人民生活为中心的请求权,是造成基层社会政治安全网络结构上的一个原因,是造成基层社会不稳定的一个原因,是造成基层社会不稳定的一个原因,是造成基层社会不稳定的一个原因,是造成基层社会不稳定的一个原因,是以就业为导向的不稳定的内在联系数,是造成基层社会不稳定的内在联系数,是造成基层社会不均衡的,2.从表1可见,M1和M22种培养基上胡萝卜根、茎、叶外植体的出愈率分别为61.6%、100%、16.7%和59.2%、100%、70.00%。由此可见,在2种培养基上都是茎的出愈率最高,另外2种外植体出愈率的高低则取决于培养基中生长调节剂的组合,在含0.1mg/L2,4-D的培养基中根的出愈率高于叶,而在含0.5mg/L2,4-D和0.5mg/L6-BA的培养基中叶的出愈率高于根。2.2织物的形态特征上述试验表明,胡萝卜幼苗的根、茎、叶作为外植体均可诱导出愈伤组织,但进一步观察发现,其愈伤组织生长状态各不相同。根外植体脱分化形成愈伤组织的速度较慢,愈伤组织为黄色,质地疏松,大小形态较一致,体积较大,直径约1cm;茎外植体脱分化形成愈伤组织的速度较快,愈伤组织为黄色,表面略带乳白色,质地致密紧凑,大小较均一,直径约0.5cm;叶外植体脱分化形成愈伤组织的速度较慢,愈伤组织为淡黄色,质地较疏松,大小形态不规则。对这三者进行比较可知,茎外植体脱分化的速度最快,愈伤组织的质量最好,出愈率也最高,因此在选取外植体时,以胡萝卜幼苗的茎段外植体为佳。2.3种外植体的愈伤组织的分化将根、茎、叶形成的愈伤组织接种于分化培养基后,茎的愈伤组织在第7天就开始出现绿芽,而根和叶的愈伤组织约2周后才出现绿芽。这说明茎的愈伤组织分化速度较快,而根和叶的较慢。不同外植体形成愈伤组织的分化率也不同,茎的愈伤组织分化率最高,达62.1%,叶的次之,为42.0%,而根的最低,仅有25.0%(表3)。这表明,进入至分化培养阶段,茎段来源的愈伤组织再生植株效果最好。2.4生根培养基分化出的正常芽苗长至2cm左右时,将其从愈伤组织上切下,移至生根培养基上,约10d左右开始生根。在生根培养基上90%的芽苗均能生根,并能正常生长(图1)。3外植体类型对愈伤组织诱导率激素的种类和浓度在愈伤组织诱导和再分化过程中起着重要作用。植物细胞具全能性,但对于特定的器官或细胞能否表现出全能性取决于是否具有合适的激素诱导。培养基中添加的生长调节剂浓度和搭配合适可促进愈伤组织的诱导和分化,否则会产生负面影响。该试验表明,以培养约2个月的胡萝卜幼苗为材料,分别取幼苗的根、茎、叶为外植体,0.1mg/L2,4-D和0.5mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA的组合对茎的愈伤组织诱导率均为100%,而含0.1mg/L2,4-D的培养基有利于根愈伤组织的诱导,而添加0.5mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA的培养基则有利于