五羟色胺受体亚型1a在螺旋神经元上的分布

五羟色胺受体亚型1a在螺旋神经元上的分布

五羟基胺是中枢神经系统中的一种常见的神经传输材料。五羟色胺作为神经传输材料在感觉神经系统中的神经传输形成了一个重要的调节网络，该网络影响各种信息机制，尤其是听觉信息的过滤。以往的研究中显示五羟色胺存在于哺乳动物传出神经系统橄榄耳蜗束中,橄榄耳蜗束是连接听觉脑干和耳蜗的传出投射,这些传出神经元在耳蜗内终止于螺旋神经元和外毛细胞的周围突,它主要对耳蜗内传导听觉信息的传入神经的活动起调节作用。因此研究表明螺旋神经元可能存在五羟色胺受体,并且对螺旋神经元进行的听觉传导活动起着重要的调节作用。五羟色胺受体有多种亚型,Oh等利用RT-PCR技术证实在小鼠的螺旋神经元上存在七种五羟色胺受体亚型,分别是1A、1B、2B、2C、3、5B以及6,并且提出5羟色胺受体亚型1A可能对机械感觉信息的传递起着调节作用。五羟色胺受体亚型1A是目前研究得最多的五羟色胺受体亚型之一,它主要与五羟色胺结合后对组织起抑制作用。Ramboz等通过试验也提出五羟色胺受体亚型1A对兴奋以及焦虑行为起调节作用,并认为五羟色胺受体亚型1A的减少将导致焦虑的加剧。由此推测当毛细胞刺激螺旋神经元引起兴奋时,五羟色胺受体亚型1A与五羟色胺结合后对螺旋神经元的听觉传导活动具有重要的调节作用。因此从形态学方面显示螺旋神经元五羟色胺受体亚型1A的分布,对于了解它在听觉活动中对螺旋神经元的作用以及作用机制具有重要的意义。而到目前为止,从形态学方面对螺旋神经元的五羟色胺受体亚型1A的分布进行研究还未见报道。酶标亲和素-生物素技术(labeledavidin-biotintechnique,LAB技术)是利用生物素-亲和素的亲和作用,将酶标亲和素连接到抗原抗体复合物上,用以显示被检测的抗原,酶标链亲和素-生物素技术(labeledstreptavidin-biolintechnique,LsAB技术)是以链亲和素(streptavidin,SA)代替了亲和素,具有灵敏度高、特异性强、背景清晰等特点。因此本研究采用LsAB技术从形态学方面研究小鼠螺旋神经元的五羟色胺受体亚型1A的分布情况,现报道如下。1材料和方法1.1实验动物出生后3~6d发育正常的乳小鼠4只,肤色正常,身体无畸形,由四川大学华西实验动物中心提供。1.2ro乡村ro钢结构专利剂固定液:冷丙酮溶液;一抗:五羟色胺1A受体抗体[(anti-serotonin1A(5-HT1A)-rReceptor,由SantaCruz公司提供];SP-9003试剂盒(由北京中杉金桥生物技术公司提供);显色剂:DAB液(由Sigma公司提供)。1.3包埋、切片在解剖显微镜下直接将其断头取出双侧耳蜗,立即用冰冻切片包埋剂(OCT)将其进行包埋,-20℃冷室切片机切片,片厚5微米,冷空气干燥20分钟,备用。每隔四张组织切片即作一张HE染色,以确定组织结构,中间间隔的四张组织切片中前三张划入实验组,后一张划入阴性对照组。1.4抗过血剂免疫法检测细胞中的免疫指标冷丙酮溶液固定组织10分钟;用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗两次,每次十分钟,吸水纸吸去多余的液体;3%H2O2去离子水室温孵育组织10分钟,用以消除内源性过氧化物酶活性,PBS液冲洗并在PBS液中浸泡5分钟;滴加封闭用正常兔血清工作液,室温下孵育10分钟,倾去,不洗;用移液管取适量浓度稀释成1∶200的五羟色胺1A受体抗体滴加在组织上,置于染色盒中保持一定的湿度,放于隔水式恒温培养箱内,37℃作用1小时,PBS液浸洗三次,每次3分钟;滴加生物素标记兔抗山羊IgG二抗工作液,放于隔水式恒温培养箱内,37℃作用15分钟,PBS液浸洗三次,每次3分钟;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP),放于隔水式恒温培养箱内,37℃作用15分钟,PBS液浸洗三次,每次3分钟;滴加DAB液进行显色,镜下观察,适时用PBS液充分冲洗以终止,防止过度显色;苏木素对组织细胞核进行复染,封片,光镜下观察。阴性对照组组织切片除一抗滴加PBS液取代滴加五羟色胺1A受体抗体外其余步骤同实验组。2模型小鼠耳蜗中螺旋神经元的细胞形态变化HE染色的组织切片确定结构,图示正中央胞体较大的细胞即为螺旋神经元(图1)。免疫组织化学结果显示,实验组中的4只乳小鼠耳蜗中螺旋神经元的细胞膜均显示明显阳性信号,即棕色(图2、3),而阴性对照组中的耳蜗螺旋神经元,在光镜下观察发现螺旋神经元的细胞膜未出现阳性信号(图4)。表明五羟色胺1A受体存在于耳蜗螺旋神经元的细胞膜上。3螺旋神经元对耳蜗核的调节作用由于哺乳动物出生以后听觉系统已经基本发育完全,同时耳蜗骨化常发生于哺乳动物出生后极短时间内,这对耳蜗进行冰冻切片带来了困难,因此本研究选用出生后3~6天的乳小鼠耳蜗进行冰冻切片,应用LsAB技术从免疫组织化学的角度直观地证实听觉传导通路中的第一级神经元——螺旋神经元的细胞膜上存在五羟色胺受体亚型1A。在实验中所应用的LsAB技术充分利用了链霉卵白素和生物素相互结合具有较强特异性和亲和力的特点,并且使用3%H2O2去离子水消除了组织内源性过氧化物酶活性以及滴加正常兔血清工作液用以封闭组织抗原,从而使组织切片经免疫组织化学染色后具有了较强的特异性、较清晰的背景以及较高的灵敏度。螺旋神经元作为听觉传导通路中的第一级神经元,位于内耳的蜗轴中,大多数的神经元发出周围突到附近单个内毛细胞的底部,每个内毛细胞接受大约10个螺旋神经元的传入末梢。这些神经元细胞体大,细胞突厚,有髓鞘,被称为I型螺旋神经元。剩下5%~10%的神经元细胞体积小,细胞突薄,没有髓鞘,它在柯替器隧道内呈放射状,形成突触和部分外毛细胞接触,不和内毛细胞接触,被称为II型螺旋神经元。螺旋神经元的中枢突由耳蜗发出,经内听道止于中枢神经系统的蜗核。因此螺旋神经元在听觉活动中起着很重要的作用。五羟色胺主要在脑神经细胞内合成,作为中枢神经系统的一种常见神经递质,它是通过作用于组织器官上的五羟色胺受体影响突触的传递,以达到神经细胞兴奋和抑制活动的平衡。五羟色胺能神经在脑内分布广泛,具有一定的储存五羟色胺、释放五羟色胺、与受体结合以及灭活五羟色胺的能力。在由五羟色胺形成的感觉神经系统调控网络中,五羟色胺能神经纤维的末梢广泛存在于中枢神经系统的大多数听觉核团,如耳蜗核、下丘、外侧丘系核和上橄榄复合体。在耳蜗核和下丘中存在五羟色胺受体亚型1A,在初级听觉皮层中也发现五羟色胺2受体和五羟色胺受体亚型1A的致密结合。离子电渗导入五羟色胺可促进或抑制听觉系统以外神经元对耳蜗核神经元的调节作用从而影响耳蜗核神经元对听觉信息的传导。这种调控机制可能通过五羟色胺的自身调节过程来完成,如五羟色胺能缝际尾核神经元,它们接受谷氨酸能神经纤维的传入信息同时又通过神经元内五羟色胺自身的调节作用影响信息的传导,这表明五羟色胺在听觉传导过程中起着重要的调节作用。另外有实验证实五羟色胺受体亚型1A是一种与G蛋白相匹配的受体亚型,它主要通过激活Giα蛋白抑制腺苷酸循环或者促进钾离子通道的开放从而对组织起调节作用。因此可推测在听觉传导过程中,螺旋神经元接受毛细胞释放的兴奋性神经递质引起兴奋时,神经传出系统橄榄耳蜗束同时会释放五羟色胺,与螺旋神经元细胞膜上的五羟色胺受体亚型1A结合,通过激活Giα蛋白抑制腺苷酸循环或者促进钾离子通道的开放,从而对螺旋神经元的兴奋起重要的反馈性调节作用。谷氨酸作为非常重要的兴奋性神经递质在螺旋神经元进行听觉传导的活动中发挥着重要作用,Nordang等证实螺旋神经元、内毛细胞、外毛细胞内有谷氨酸存在,而且螺旋神经元内还存在谷氨酰胺合成酶和离子型NMDA受体的亚型NMDAR2。同时蒋明等也提出谷氨酸能够使螺旋神经元的复合动作电位幅度提高,从而引起螺旋神经元产生过度兴奋,高剂量的谷氨酸还会引起螺旋神经元发生不可逆的神经变性。这些说明在听觉传导过程中,螺旋神经元接受毛细胞释放的谷氨酸产生兴奋从而完成它对听觉信息的传导。另一方面,Vicente-Torres等发现在耳蜗中存在传递五羟色胺的物质,并进一步说明耳蜗内存在五羟色胺能突触活动。Bobbin等也认为五羟色胺主要作用是降低豚鼠听觉神经的复合动作电位。并且已有研究证实五羟色胺存在于哺乳动物橄榄耳蜗束中,这个系统由两部分组成,一部分为无髓鞘轴突,来源于外侧上橄榄核小的纺锤状神经元(同侧占主导),另一部分为有髓鞘轴突,来源于橄榄核周围的大星状神经元,主要来源于同侧的内侧上橄榄核周围或者对侧的斜方体腹侧核;而且前者通过轴、树突与I型螺旋神经元连接,后者则与部分外毛细胞接触。故这些也可推测在螺旋神经元进行听觉信息的传导过程中,通过毛细胞释放的谷氨酸产生兴奋从而完成听觉信息的传导,同时也接受橄榄耳蜗束释放的五羟色胺对其进行的听觉传导活动起反馈调节作用。但由于有实验指出在白噪声(持续1h,90dBSPL)水平下五羟色胺对听觉活动无明显的调节作用,因此五羟色胺在什么样的听觉传导过程中对螺旋神经元的兴奋起调节作用需要进一步通过其它独特的实验研究证实。因此,以上这些可推测螺旋神经元作为听觉通路中的第一级神经元,当毛细胞释放兴奋性神经递质(如谷氨酸)引起螺旋神经元兴奋时,中枢会通过传出神经系统橄榄耳蜗束释放五羟色胺与螺旋神经元细胞膜上的五羟色胺受体亚型1A结合,通过激活Giα蛋白抑制腺苷酸循环,或者促进钾离子通道的开放对螺旋神经元进行的听觉传导活动起着重要的反馈性调节作用。螺旋神经元内五羟色胺受体亚型1A分布情况的研究对于了解在听