铁皮石斛的市场前景

铁皮石斛的市场前景

喂食侧柏属植物和多年生附生草本植物，茎的茎为黑色，也被称为黑节草，主要分布在浙江、云南、广西、湖南、贵州等地。铁皮石斛是我国传统名贵中药材,具有滋阴清热、益胃生津、润肺明目、清咽利嗓、抗癌防老等功效,是2010版《中华人民共和国药典》唯一单列收载的石斛属植物。铁皮石斛的种子极小、无胚乳,自然条件下需与某些真菌共生才能萌发,很难用实生苗栽培,而传统的分株、扦插等方式的繁殖率极低,加上人为的过度采挖和破坏生态环境,其资源已濒临灭绝,因而被国家列为重点保护的药用植物之一。为满足国内外市场经济发展和临床医学的需要,从20世纪70年代开始,国内科研工作者开始对铁皮石斛组织培养和人工栽培进行研究,20世纪80年代,浙江省医学科学院率先对铁皮石斛组织培养技术取得突破并用于生产,国内掀起了铁皮石斛的组织培养热。笔者就近年来铁皮石斛无菌播种,原球茎诱导、增殖及分化、壮苗生根,丛生芽的诱导,离体开花,人工种子与种质资源保存,四倍体诱导等组培技术的研究现状进行综述,以便为今后的研究提供参考。1无菌播种热带附生兰的种子,可以通过处理,以无菌萌发的方式进行萌发建立无性繁殖系。1.1种子萌发期不同不同胚龄的铁皮石斛种子,萌发率和萌发期明显不同。叶秀粦等、曾宋君等对不同胚龄铁皮石斛种子诱导培养发现:幼胚胚龄在2月以下时,种子萌发率很低,随着胚龄的增长,其萌发率逐渐升高,萌发期逐渐缩短,达一定的胚龄后,萌发期差异并不显著。2月以下的种胚播种时发育不良,萌发率低;过晚播种则果皮开裂,果实内的种子易受污染,难以消毒。因此采用4月胚龄的铁皮石斛种子无菌播种最佳,这时种子成熟度高、果实尚未破裂,易进行无菌播种,种子萌发率高且萌发后的生长状况好。1.2不同培养基对铁皮石斛种子萌发的影响采用合适的培养基是铁皮石斛种子萌发的关键,B5、1/2B5、N6、1/2N6、MS、1/2MS、SH、1/2SH、WPM、VW、KundsonC、White和HyponexNO.1等多种基本培养基都可使铁皮石斛种子萌发,但萌发所需的时间、萌发率及小苗长势不同。曾宋君等在研究铁皮石斛等石斛种子在MS、KS、VW、KnudsonC、N6为培养基进行离体培养时,得出了硝态氮远高于铵态氮的N6培养基有利于石斛的萌发和生长。郑志仁等利用MS、1/2MS、B5、N6、KC为培养基对铁皮石斛进行诱导培养,得到不同的结论:在MS、1/2MS培养基上萌发率较高,在KC培养基上次之,N6培养基上较低。杜刚等利用VW培养基对铁皮石斛进行诱导也取得了较高的萌发率。谢启鑫等利用MS、1/2MS、HyponexNO.1培养基进行诱导培养,得出1/2MS适合铁皮石斛的种子培养结论。曾万勇等利用WPM、MS、1/2MS和1/3MS培养基进行诱导培养,在WPM培养基中发芽率最高,但对MS培养基来说,与谢启鑫等得出结论相似:较适宜的培养基为1/3MS和1/2MS,最不适宜的为MS培养基。从曾万勇、谢启鑫等研究结果可得出:在低盐浓度的培养基中易于诱导铁皮石斛种子萌发,高盐离子不利于铁皮石斛的萌发与生长。因此在研究及实际生产中大多采用1/2MS培养基作为种子诱导培养基。1.3激素对铁皮石斛种子萌发的影响铁皮石斛种子在基本培养基上可以萌发,但添加适当比例的激素或天然附加物能提高萌发率,并加快萌发速度和生长速度。郑志仁等研究认为0.5~1.0mg·L-16-BA对铁皮石斛种子萌发有抑制作用,但有促进原球茎增殖效果;而0.5~1.0mg·L-1NAA则促进铁皮石斛种子萌发,不仅萌发率增高,而且萌发整齐,与曾宋君等结论相同。李荣珍研究认为铁皮石斛种子萌发的各种激素影响因子依次为NAA、2,4-D,并得出较适合铁皮石斛种子萌发的培养基是1/2MS+NAA0.3mg·L-1+蔗糖30g·L-1。张铭等研究认为NAA在0.05~2.0mg·L-1范围内都能促进种胚萌发,而2,4-D促进种胚萌发的浓度范围很窄,仅在浓度为0.5mg·L-1时能促进种胚萌发。周丽研究认为NAA浓度在0.2~0.5mg·L-1最适合胚的萌发和生长,高于5mg·L-1则起抑制作用;6-BA对胚萌发后胚状体的形成和生长有抑制作用,但其用量小且又有NAA存在的情况下能形成胚状体和分化小芽。杜刚等用实验设计软件Design-Expert6.0.6进行Simplex-Lattice实验设计和优化,得出铁皮石斛种子萌发的各种激素影响因子依次为NAA、GA、6-BA,优化激素组合为:NAA0.18mg·L-1+6-BA0.53mg·L-1+GA0.28mg·L-1。由此可见,铁皮石斛种子不需要外源激素即可萌发,单独加BA抑制种子萌发,NAA或BA与NAA适宜比例的组合能促进其萌发。通过研究表明,在培养基中添加10%椰子汁、10%马铃薯汁等天然营养物质,对铁皮石斛种子萌发和生长都有明显的促进作用。添加适量活性炭可防止褐变,对幼苗成长有利,但对种子萌发无明显影响。而杨柳平等则认为在培养基中添加天然提取物不利于种子萌发。2组培快繁的主要形式原球茎繁殖是兰科植物组织培养的特有现象,是其组培快繁的主要形式。以铁皮石斛茎尖、茎段、根尖等为外植体诱导原球茎已获得成功,但选用不同的外植体,所采用的培养基配方及培养效果各有所不同。2.1外植体的选择2.1.1上诱导对原球茎的诱导茎尖是细胞分裂最旺盛部分,诱导成功率较高。王春等用铁皮石斛的茎尖作为外植体,接种1/2MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1培养基上诱导产生原球茎,诱导率为58%。张启香等研究认为,以1/2MS为基本培养基有利于原球茎诱导,原球茎最优诱导培养基为1/2MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.05mg·L-1+KT0.1mg·L-1+LH1.0g·L-1,并得出土豆汁对原球茎的增殖有很好的促进作用的结论。而温焱光等采用基本培养基不同,他们将茎尖和腋芽接种于MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1培养基上诱导,20d诱导出愈伤组织,2个月后获得原球茎。2.1.2最佳培养基的确定铁皮石斛带芽茎段取材容易,诱导成功率高,是理想的外植体。常美花等研究认为铁皮石斛带芽茎段原球茎诱导的最佳培养基为MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+AC2.0g·L-1;而不加激素的MS培养基铁皮石斛的原球茎诱导率为0。李丹等研究也认为不加激素的MS培养基铁皮石斛的原球茎诱导率为0,原球茎诱导的最佳培养基是MS+KT1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1;NAA是原球茎诱导的关键因子,适宜的KT与NAA配比对原球茎诱导有促进作用。苏钛等则认为NAA并不是原球茎诱导的关键因子,他们用正交设计方法对铁皮石斛原球茎诱导具有影响的激素BA、NAA、KT以及马铃薯汁进行配比研究,结果表明:以茎段为外植体在培养基MS+BA2.0mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+马铃薯汁10%+糖3%,具有很好的原球茎诱导作用,50d后诱导率达95.20%;对BA、NAA、马铃薯汁进行LSD多重比较分析,BA浓度2.0mg·L-1和0.5mg·L-1之间均值差异大,存在显著差异,而且在浓度2.0mg·L-1时原球茎诱导率最高。NAA和马铃薯汁对诱导率无显著影响,但是当NAA2.0mg·L-1,马铃薯汁10%时,诱导的原球茎分化少,原球茎质地较好,因此为最佳浓度BA相对于其他激素对铁皮石斛原球茎诱导效果最好,以2.0mg·L-1BA诱导率最高。2.1.3抗吸能力分离株的获得再生以铁皮石斛根尖为外植体诱导原球茎的诱导率相对较低。詹忠根等以铁皮石斛离体根尖诱导类原球茎表明,外植体在改良B5培养基诱导培养形成了愈伤组织、类原球茎或直接转化成芽且获得再生植株。2.2甘蔗的原始繁殖和分解2.2.1最佳培养基的筛选原球茎增殖是铁皮石斛组织培养过程中一个十分关键的环节,通过原球茎增殖,可为之后的分化、壮苗生根奠定基础。张治国等研究了6种基本培养基(1/2MS、MS、N6、B5、KC、VW)对原球茎增殖的影响,其中1/2MS培养基上的原球茎色淡黄,体积大,无分化且增殖适宜,是适宜铁皮石斛原球茎增殖的基本培养基。培养基中不同激素浓度配比对原球茎增殖具有重要影响。杨柳平等通过研究认为不同激素配比对原球茎增殖效果不同,NAA、KT、6-BA在适宜的浓度时对原球茎的增殖起促进作用。戴传云等用正交试验筛选出铁皮石斛原球茎增殖的最佳培养基为1/2MS+2.0mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA+1.0mg·L-1KT;该研究结果认为,在一定范围内,在含有高浓度的6-BA和低浓度的NAA的1/2MS培养基上,原球茎增殖系数大,增殖效果较好;KT在铁皮石斛原球茎增殖的过程中虽不是必要激素,但加入KT能明显提高原球茎的增殖速率。张桂芳等认为2,4-D对原球茎的生长和增殖不利,一定浓度的BA、KT和NAA有利于原球茎的增殖;KT浓度为1.0mg·L-1时,原球茎40d增殖倍数最高,达9.0。2.2.2高浓度细胞分裂素ba与低浓度生长素naa组合原球茎进行分化可形成丛生芽,不同培养基对石斛原球茎分化整齐度、健壮度、分化率影响不一。张治国等研究认为,高浓度细胞分裂素BA与低浓度生长素NAA组合,即2mg·L-16-BA和0.2mg·L-1NAA组合(10∶1),能使原球茎分化的速度加快。邵世光等以N6为基本培养基,激素配比与张治国等相似:2mg·L-16-BA和0.2mg·L-1IBA组合(10∶1),原球茎最易于分化成丛生小苗。2.2.3马铃薯汁对原球茎的影响通过研究表明,培养基中添加物不同,原球茎继代增殖及分化效果也不同。香蕉汁有利于原球茎的继代增殖,马铃薯汁能明显促进原球茎的分化。杨柳平等则认为添加苹果汁对铁皮石斛原球茎的增殖效果好,土豆汁能有效促进铁皮石斛原球茎的分化,但香蕉汁对原球茎的增殖和分化有抑制作用。蔗糖作为培养基的能源物质和渗透调节剂,对原球茎的增殖生长影响也较大,3%蔗糖浓度有利于原球茎增殖,而2%蔗糖浓度有利于原球茎分化。2.3植物激素种类的选择有关研究表明,一般在不加激素的播种培养基上铁皮石斛种苗会自动生根,但添加香蕉汁、蔗糖、活性炭等对生根壮苗有明显促进作用,而添加激素对生根影响极大。刘骅等对基本培养基、天然提取物、香蕉提取物浓度和激素种类的选择进行了研究,结果表明铁皮石斛壮苗基本培养基以B5或1/2MS为好,天然提取物选用香蕉汁,香蕉汁浓度为10%,植物激素以2mg·L-1的NAA较好。陈兆贵等研究认为组培苗的壮苗生根在1/2MS+IBA2.0mg·L-1+水解酪蛋白500mg·L-1+10%香蕉提取液的培养基上效果较好,45d生根率达92%。3丛生芽的培养以铁皮石斛带芽茎段为外植体直接诱导腋芽,再将腋芽培养形成丛生芽是铁皮石斛快速繁殖的一种新途径。采用带芽茎段离体培养丛生芽,不经过愈伤组织阶段,能直接萌发出芽,有利于保持该品种遗传性状稳定。在外植体选择方面上,李进进研究认为,选用一年生嫩茎中部茎段诱导培养,产生的丛生芽数量多,芽的平均长度长而且生长良好。朱艳等以铁皮石斛的茎段作外植体,比较不同的培养基、激素等因素对茎段分化丛生芽的影响,以及不同浓度的香蕉汁和活性炭对试管苗生根的影响。研究结果表明:1/2MS较好,BA作用优于KT、ZT,最适浓度为2.0mg·L-1;丛生芽培养于1/2MS+10%香蕉汁+0.5%AC的培养基上,生根效果最好。这与郭洪波等研究结果有所不同,郭洪波等研究认为,外植体在MS+6-BA5.0mg·L-1+NAA(0~0.8mg·L-1)上诱导丛生芽最好,诱导率高达93.33%,增殖培养基为MS+6-BA5.0mg·L-1+NAA0.4mg·L-1+20%香蕉汁。洪森荣等研究认为,不添加任何植物激素的MS对铁皮石斛带芽茎段根的分化最为有利,但添加了KT和NAA后,对芽的分化有促进作用,细胞分裂素KT与生长素NAA配比高的培养基,繁殖系数高,反之繁殖系数低。4激素对铁皮石斛花芽形成的调控在离体培养条件下,铁皮石斛可在试管、广口瓶等培养容器中开花。王光远等研究了多种植物激素和多胺对铁皮石斛组织培养中花芽形成的影响,表明在培养基中加入合适浓度的亚精胺或BA,或同时加入NAA和BA均可诱导原球茎或由之形成的无根小苗在3~6个月开花,频率在31.6~45.8%之间。当将原球茎在加有ABA的培养基上预培养后再移到加有BA的培养基上,花芽形成的频率可提高到82.8%(个别实验中可达100%)。周丽将3个月苗龄的组培苗在KaudsonC+2,4-D0.2mg·L-1+ZT0.6mg·L-1的培养基上继代培养2个月后,可诱导出一定数量的花芽,然后转接于KaudsonC+香蕉提取物100g·L-1的无激素的培养基上可正常开花,花大且形态正常,花期3周左右。岑秀芬等研究了激素因子对铁皮石斛离体培养开花诱导的效应,表明PP3330.3mg·L-1+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+TDZ0.06mg·L-1为适宜的激素组合,其花芽形成率和花开放率高达80.4%和90.3%。通过离体开花技术可制作成铁皮石斛微型观赏品,具有运输方便、无需管理等优势。由于组织培养过程中有一定的变异率,可通过离体开花筛选新的花型,通过杂交可进一步培育株型高大、兼具药用价值和观赏价值的优良石斛品种。5人工种子和胚胎血浆资源的保存铁皮石斛自然条件下种子萌发率极低,通过人工种子或低温等处理,可有效保存并开发种质资源。5.1炭或淀粉添加量郭顺星等以原球茎为材料,以改良1/2MS培养基各种成分附加蔗糖为人工胚乳,初步建立了铁皮石斛人工种子制作流程。张铭等应用粘土和蛭石粉作基质包埋铁皮石斛种胚来制作人工种子,当粘土∶蛭石粉∶MS培养液为2∶1∶2时萌发率可达56.8%。在此系统中单独添加1.0%活性炭或同时添加1.0%活性炭和0.5%淀粉制作的铁皮石斛人工种子,平均萌发率分别达76.7%和80.3%。张桂芳等对人工种子制作及影响因素进行了研究,表明以MS+0.5mg·L-1BA+0.5mg·L-1NAA+3g·L-1AC+30g·L-1海藻酸钠+3g·L-1百菌清为基本胚乳,在2%CaCl2中反应15min是铁皮石斛人工种子制作的较佳条件,胚乳中分别添加15g·L-1木薯淀粉和10g·L-1保水剂能明显提高人工种子的萌发率和成苗率,种皮中添加10L纳米SiO2和10L纳米TiO2均能明显提高萌发率,但添加10L纳米SiO2成苗率最高。曾颖苹等进行了铁皮石斛人工种子包衣技术研究,表明以萌发原球茎为繁殖体的人工种子萌发率和成活率较高,适宜的人工胚乳组合为蔗糖3.0%、ABA1.0mg·L-1、活性炭浓度0.5%、多菌灵3.0%、海藻酸钠3.0%。5.2超低温保存研究史永忠等将铁皮石斛试管苗培养在1/2MS,附加0.5mg·L-1NAA、20mg·L-1蔗糖、0.5g·L-1活性炭和7g·L-1琼脂的培养基上,室温条件下连续保存12个月,存活率达100%。王君晖等用液氮对铁皮石斛的种子、原球茎和类原球茎体进行了超低温保存研究,表明把4个月龄的种子脱水至含水量为12~19%,能获得较高的冻后存活率(95%)和较快的恢复生长速率;原球茎用玻璃化保护剂PVS2处理15min,其冻后存活率可达88%;类原球茎的含水量在6~7d内干燥至30±2%,其冻后存活率可达48~80%。陈勇等对铁皮石斛的原生质体、原球茎进行了玻璃化法超低温保存研究,存活率分别达48%和88%。林伟强等用空气干燥法成功地冻存了铁皮石斛的种子及初生原球茎。罗吉凤等研究表明离体保存材料可采用试管丛芽和原球茎两种方式,以保持其遗传多样性。保存方法是:在15℃左右条件下,保存离体材料,继代间隔期为12~18个月;也可以采用室温保存,在1/2MS+蔗糖1%培养基上,继代间隔期可延长至10~12个月。6铁皮石斛的诱导与二倍体