芦丁与血清白蛋白的结合作用

芦丁与血清白蛋白的结合作用

立法及药物作用机制黄酮类化合物广泛存在于中药和植物中。它是一种具有广泛药理活性的天然化合物。芦丁(Rutin)3’,4’,5,7-四羟基黄酮-3-芸香糖苷,又名芸香苷、紫槲皮苷,是槲皮素的3-O-芸香糖苷(结构式见图1),天然植物槐米等中药的有效成份,属于黄酮类化合物,具有维生素P样的作用。据医书记载,槐花有多种医药保健功能,如《日华子木草》中说槐花“治五痔、心疼、眼疾”。芦丁是临床上广泛使用的具有高效抗炎作用的药物,具有维持血管抵抗力,降低其通透性,减少脆性等作用,其在临床上主要用于防治脑溢血,高血压,视网膜出血和治疗慢性气管炎等疾病。血清白蛋白是血浆中最为丰富的蛋白质,不仅对维持渗透压起重要作用,而且能与进入血液中的大部分内源性和外源性物质如药物等进行可逆的结合从而起到在体内转运的作用。药物与白蛋白的亲和力大小也影响到药物在体内的分布、清理以及通过改变血液或组织中游离药物浓度来影响药效。因此,研究药物与血清白蛋白的结合作用对理解药物的作用机制具有重要意义。关于研究芦丁与血清白蛋白作用的紫外-可见光谱和荧光光谱法已有报道,本文在此基础上,进一步用热力学法研究芦丁与血清白蛋白的作用机制,得出了芦丁与血清白蛋白的结合常数、结合位点数和结合过程的基本热力学参数,为芦丁在体内的储存、运输、作用机理及临床试验提供有用的信息。1实验部分1.1实验试剂和仪器LS-55荧光分光光度计(美国PerkinElmer公司),pHS-25型酸度计(上海第二分析仪器厂),TB-85型恒温器(日本岛津公司),牛血清白蛋白(BSA)为国药集团化学试剂有限公司产品,人血清白蛋白(HSA)为华兰生物工程股份有限公司产品,芦丁(Rutin)为sigma公司产品,用无水甲醇配成1.0×10-3mol·L-1储备液,配制10mmoL·L-1Tris-HCl缓冲溶液,pH7.38(内含0.15moL·L-1NaCl,维持离子强度),实验用水为去离子二次蒸馏水,其余试剂均为分析纯。1.2芦丁存在的荧光光谱在一系列10mL的比色管中,加入一定体积的BSA(HSA)溶液,然后依次加入不同体积的芦丁溶液,以pH7.38Tris-HCl缓冲溶液定容,在λex=280nm,λem=348nm处扫描BSA(HSA)荧光光谱及BSA(HSA)在芦丁存在下的荧光光谱。2结果与讨论2.1荧光光谱2.1.1静态符合动态加强的特性蛋白质分子中因含有三种芳香族氨基酸——色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸而产生内源性荧光。当某些小分子如药物与蛋白质结合后,会导致其荧光强度下降,这种现象称为荧光猝灭作用。由图2可知,随着芦丁浓度的增加而BSA(HSA)体系的荧光强度逐渐降低,表明芦丁与BSA(HSA)之间发生了结合作用从而猝灭了BSA(HSA)的荧光。由于BSA(HSA)溶液的体积(5mL)远远大于所滴加的芦丁溶液的体积(≤100μL),所以可忽略稀释效应。荧光猝灭过程通常可以分为动态猝灭作用和静态猝灭作用两类。动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的相互作用过程。其作用过程遵循Stern-Volmer方程F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q](1)F0/F=1+Κqτ0[Q]=1+ΚSV[Q](1)其中F0为未加猝灭剂时的荧光强度;F为加入猝灭剂后的荧光强度;Kq为双分子猝灭过程的速率常数;τ0为没有猝灭剂存在时荧光分子的平均寿命;KSV称为Stern-Volmer猝灭常数,是双分子猝灭速率常数与单分子衰变速率常数的比率;[Q]为猝灭剂的浓度。静态猝灭是猝灭剂和荧光物质分子在基态时生成不发光的配合物,从而导致荧光物质荧光强度降低的过程,此过程可用下式描述F0/F=1+K[Q](2)F0/F=1+Κ[Q](2)式中F0,F和[Q]与(1)式相同,K是基态配合物的形成常数。比较式(1)和式(2)可以看到,无论是静态猝灭还是动态猝灭,F0/F-1与[Q]之间存在着线形关系(见图3)。各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞速率常数为2.000×1010L·(mol·s)-1,τ0为无猝灭剂时荧光分子的平均寿命,生物大分子的荧光平均寿命τ0约为10-8s。从表1可知,芦丁对HSA和BSA荧光的猝灭过程速率常数都大于最大扩散控制的速率常数,初步判断此猝灭过程为形成了复合物的静态猝灭。温度升高将增大分子扩散系数,从而增大发生碰撞猝灭的可能性,但在表1中,动态猝灭常数KSV随着温度的升高而减小了,这表明芦丁对HSA和BSA的荧光猝灭作用不是由扩散和碰撞引起的动态猝灭,而是生成了Rutin-HSA(BSA)复合物,进一步证明芦丁对HSA和BSA的荧光猝灭作用是静态猝灭,并且该复合物随着温度的升高而稳定性下降,从而导致了该复合物的结合常数随温度的升高而降低。2.1.2芦丁与bsa和hsa的反应的力学性质在静态猝灭作用中,荧光强度与猝灭剂的关系可由静态猝灭公式表示。logF0−FF=logKA+nlog[Q](3)logF0-FF=logΚA+nlog[Q](3)由式(3)以lg(F0-F)/F对lg[Q]作图可得一条直线,通过斜率和截距求出芦丁与BSA和HSA分子的结合常数KA(见表1,KA即K)及结合位点数n(见表2)。本文所求得的结合常数与文献报道的形成常数(Rutin-BSA,1.25×106和Rutin-HSA,1.67×106)有一定差别。当温度变化不大时,结合反应的焓变ΔΗ可看成一个常数,由以下热力学公式可求得芦丁与BSA和HSA反应的有关热力学参数(见表3)。lnK2/K1=ΔH(1/T1−1/T2)/R(4)ΔG=ΔH−TΔS=−RTlnK(5)lnΚ2/Κ1=ΔΗ(1/Τ1-1/Τ2)/R(4)ΔG=ΔΗ-ΤΔS=-RΤlnΚ(5)反应的ΔG<0,从热力学角度来看,证明该结合反应能够自发进行;反应的ΔΗ<0,为放热反应,升高温度将不利于其向生成rutin-HSA(BSA)复合物的方向进行。这与静态结合常数显示的310K时的KA值比295K时的KA值小相符合。荧光能量转移可分为辐射能量转移和非辐射能量转移,若发生辐射能量转移,会导致物质的荧光光谱畸形。图2中HSA和BSA的荧光光谱都没有畸变,因此HSA(BSA)与药物芦丁之间的能量转移不应为辐射能量转移。非辐射能量转移包括分子内能量转移和分子间能量转移。若供能体与受能体结合生成了复合物,则两者之间的能量转移为分子内能量转移,否则为分子间能量转移。由上述分析可知,HSA(BSA)与芦丁之间的能量转移应属于分子内的非辐射能量转移。2.2分子间相互作用力讨论了22和37℃的水溶液中药物芦丁与HSA和BSA的结合作用。有机小分子和蛋白质等生物大分子之间的结合力主要有疏水作用力、氢键、VanderWaals力和静电引力等。不同分子与蛋白质结合力的类型是不同的。根据文献,当反应的焓变ΔH>0,熵变ΔS<0时,分子之间的相互作用力来自于静电作用和疏水作用力;反应的焓变ΔH<0,熵变ΔS<0时,分子之间的相互作用力来自于范德华力、氢键或质子化等作用力;ΔH≈0,ΔS>0时,可能为疏水作用力;ΔH<0,ΔS>0时,可能为静电引力;由实验结果的热力学参数值判断芦丁与HSA和BSA之间的作用力主要为范德华力、氢键。3芦丁与牛血清白蛋白的作用力本文研究结果表明,芦丁对牛勋清白蛋白和人血清白蛋白的荧