微生物与环境监测

微生物与环境监测

MicrobiologyDepartment.CollegeofResource&EnvironmentSWU.LiYong一、指示微生物指示微生物（indicatormicroorganism）或称指示菌（indicatorbacteria）是在常规环境监测中，用以指示环境样品污染性质与程度，并评价环境卫生情况的具有代表性的微生物。主要生物性污染：细菌、真菌、病毒等各类微生物都有。1.细菌总数细菌总数（totalbacteriacount）：指环境中被测样品，在一定条件下（培养基成份、培养温度和时间、pH、通气情况等）培养后所得的1m1或lg检样中所含的细菌菌落总数。它反应环境中异养型细菌的污染度，也间接反应一般营养性有机物的污染程度。1．液态与固态对象中的细菌总数天然水体、饮水、饮料等液体物土壤、污泥、堆肥、食品、化装品、药物等固态物，常用倾注平板培养法或平板表面涂布培养法。国家卫生原则中要求：营养肉汤琼脂培养基，将经过一定倍数稀释的样品悬液，定量接种于琼脂培养基平板，或倾注混匀，或表面均匀涂布；在有氧条件下，37℃培养48h观察平板上菌落生长成果。2．空气中的细菌总数平板暴露沉降法仪器法

平板暴露沉降法：采用直径9cm平皿，将营养琼脂平板在1.2m高处暴露5min，37℃培养48h，计数生长菌落数。测定的成果不是十分精确。经济以便，有实用价值。仪器法中以固体撞击式采样器多用。成果：采用个／m1为单位来表达cfu（colonyformingunit）表达：指单位体积、单位表面积或单位质量检样中的菌落形成单位。细菌总数的卫生原则对象样品细菌总数/（cfu/ml或g）霉菌数/（cfu/ml或g）饮用水*1100水矿泉水*2水源水＜5灌装水＜50体游泳池水*3≤1000消毒牛乳≤30000全脂奶粉特级≤20000食*一级≤30000二级≤50000肉灌肠类出厂≤20000销售≤50000糕点、面包冷加工出厂≤5000≤100品销售≤10000≤150糕点、面包冷加工出厂≤1000≤50销售≤1500≤500化*5眼部、口唇、口腔黏膜≤500≤100妆儿童化妆品≤500≤100品其他化妆品≤1000≤100药*6中药片剂≤10000≤500丸剂≤50000≤500品散剂≤100000≤500我国公共场合空气细菌总数原则*撞击法/（cfu/m3）沉降法/（个/皿）适用范围≤1000≤103～5星级以下宾馆，饭店≤1500≤102星级以下宾馆和非星级带空调宾馆，饭店≤2500≤300普通饭店，招待所，酒吧，茶座，咖啡厅，图书馆，博物馆，美术馆，飞机客舱≤4000≤40影剧院，音乐厅，录像厅，医院候诊室，候机室旅客列车车厢，轮船客舱，饭馆（餐厅）≤7000≤75展览馆，商场（店），候车室，候船室≤4000≤40游泳馆2.霉菌和酵母菌总数霉菌和酵母菌数（fungiandyeastcount）是指环境中被测样品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或lm1检样中所含的霉菌和酵母菌菌落数。霉菌和酵母菌是异养型微生物，能致病或产毒素。

检测措施用倾注培养平板法。多采用孟加拉红（虎红）培养基、高渗察氏培养基或加有抗菌素的马铃薯—葡萄糖培养基。环境样本作一定倍数稀释后，定量注入灭菌平皿。倾入培养基混匀，凝固后置入25～28℃温箱培养3～5天观察平板上菌落生长情况并计数。成果：以每毫升或每克检样中菌落形成单位（cfu／m1或g）来表达。二、粪便污染指示菌病原菌一般在环境中存在的数量不大，而且检测措施较复杂，难以直接测定。其他微生物作为代表，间接指示肠道病原菌存在。粪便污染指示菌。理想条件：（1）是人畜粪便中的正常菌，且数量比粪便中其他菌为多；（2）受人畜粪便污染的环境中可检出，而未受污染环境无该菌存在；（3）排出至环境后，该菌存活时间与肠道致病菌相当或略长；（4）对氯等消毒剂及其他不良原因的抵抗力略强于肠道致病菌；（5）检出与鉴定措施比较简便迅速。大肠杆菌较理想，109个／ml；但鉴定措施比较复杂；具有大肠杆菌在内的总大肠菌群与粪大肠菌群。1.总大肠菌群总大肠菌群（totalco1iform），也称大肠菌群（coliformgroup或co1iform）；它们是一群能在37℃，24h内发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。形成特殊的菌落特征；大肠菌群不是分类学上的一种名称，而是人为定义的名词。肠杆菌科细菌主要涉及4个菌属：埃希氏菌属（Escherichia）在此菌属中与人类生活亲密有关的仅有一种种，即大肠埃希菌也称大肠杆菌；其次有柠檬酸杆菌属或称枸橼酸杆菌属（Citrobacter）、克雷伯菌属（Klebsiella）、肠杆菌属（Enterobacter）。（1）测定措施1．多管发酵法（multiple-tubefermentation），又称最大可能数法（mostprobablenumber，MPN）主要环节：①初发酵试验：加入具有乳糖蛋白陈培养基（液）中，经37℃培养24h，观察产酸产气情况以初步鉴别是否有大肠菌群存在。②平板分离。将初发酵试验产酸产气的发酵管分别接种在伊红美蓝琼脂平板上，置37℃培养24h，观察菌落形态。挑选可疑为大肠菌群细菌的菌落涂片、革兰氏染色、镜检和进行证明试验。③复发酵试验（证明试验）。上述可能为大肠菌群的菌落再次接人乳糖蛋白陈培养液，置37℃温箱培养24h后观察成果。观察成果：复发酵试验中仍有产酸产气者即最终确证为有大肠菌群存在。根据初发酵管的数目及试验所用的检样量，利用数理统计原理或查阅专用统计表，最终算出每毫升检样中大肠菌群的最可能数目。2.滤膜法（membranefiltrationtechnique，MFT）水样滤膜抽滤细菌滤膜培养，鉴定并计数经典菌落，计算总大肠菌群数。主要环节：①水样过滤②培养观察成果：经过菌落特征及镜检菌体形态初步拟定大肠菌群细菌；凡革兰氏阴性无芽孢杆菌再接入含乳糖蛋白陈培养基中以确证为大肠菌群细菌；最终根据经过水量及滤膜上长出的肯定为大肠菌的菌落数换算出每升水中大肠菌群数。成果体现方式：大肠菌群数又称大肠菌指数，其表达措施有多种，地表水环境质量原则、生活饮用水卫生原则、游泳池水卫生原则中以个／L表达之；食品卫生原则中用个／m1表达。大肠菌群值是指水样可检出1个大肠菌群细菌的最小水样容积，此值愈大即表达水中大肠菌群数愈少。水：大肠菌群值＝1000m1／大肠菌群数土壤大肠菌群值＝lg／大肠菌群数样品总大肠菌群粪大肠菌群I≤200个/L地表水*1II≤2000个/LIII≤10000个/LⅣ≤20000个/LⅤ≤40000个/L游泳池水*2≤18个/L饮用水0个/100ml0个/100ml医院排放污水*3一级≤500个/L二级≤1000个/L三级≤5000个/L瓶装汽水≤6个/ml含乳饮料≤40个/ml天然矿泉水不得检出/ml蜂蜜≤30个/ml白糖≤30个/ml熟肉制品≤30个/ml消毒牛乳≤90个/ml酸牛乳≤90个/ml全脂乳粉≤40个/ml措施评价（1）发酵法：（MPN法）环节多，耗时长，得到成果需要72h，不能及时指导实践工作。（2）滤膜法（MFT法）：操作简朴，可现场过滤水样，防止运送水样的麻烦，且缩短时间。但此法不合用于混浊度高的水样。（3）总大肠菌群中细菌并非全部来自粪便，可能由腐败的植物、土壤等其他环境带来，放可能造成某些不精确性。（4）饮水加氯消毒可杀灭大肠菌群而难杀灭肠道病毒，故大肠菌群不能指示水中病毒。2.粪大肠菌群粪大肠菌群（fecalco1iform）是能在44.5℃（44～45℃）发酵乳糖的大肠菌群，亦称耐热性大肠菌群（thermoto1erantcoliform）。涉及4个属，埃希氏菌属为主，其他3个属数量较少。多数大肠杆菌的菌种能够在44～45℃条件下生长。粪大肠菌群数与粪便中大肠杆菌数直接有关，在人粪中粪大肠菌群细菌占总大肠菌群数的96.4％；在外环境中粪大肠菌群不易繁殖，粪大肠菌群较总大肠菌群作为粪便污染指示菌意义更大。常用的措施也有多管发酵法和滤膜法。多管发酵法是自总大肠菌群乳糖发酵试验的阳性管中取1滴转种于EC培养基，44.5℃培养。然后观察成果。用滤膜法检测时采用的培养基有区别，总大肠菌群滤膜法采用的固体培养基为品红亚硫酸盐（钠）培养基，粪大肠菌群则采用FMC培养基。水中粪大肠菌群与肠道病原微生物具有有关性，是粪大肠菌群作为指示菌的主要根据；水体种类每100ml水样粪大肠菌群数水门氏菌检出情况检样件数阳性检出数目百分率/%淡水1～20029827.6201～2000271985.2＞2000545398.1海水1～70184126.571～200742128.4201～2000914044.0＞20007545603.粪链球菌粪链球菌（Streptococcusfaecalis）是短链状的革兰氏阳性球菌。在人粪便内数量诸多，每克成人粪便中约具有2×108个，仅次于大肠菌群细菌。其为粪便污染指示菌的优点是在水中不会自行繁殖，但抵抗力弱于病菌。粪链球菌可为水质细菌学评价提供有意义的补充材料。因为人粪便中粪大肠菌群数多于粪链球菌，动物粪便中则相反，所以，在水质检测时可根据两菌菌数比值不同而推测粪便污染的起源。粪大肠菌群／粪链球菌的比值（Fe／Fs）不小于或等于4，则觉得污染主要来自人粪；如不不小于或等于0.7，则觉得污染主要来自温血动物的粪便；如比值不不小于4而不小于2，则为混合污染但以人粪为主；如比值不不小于1而不小于0.7，则为混合污染但以动物粪便为主。4.产气英膜梭菌产气英膜梭菌（Clostridiumperfringenes）为革兰氏阳性具有芽孢、能还原亚硫酸盐的厌氧杆菌。存在于人粪（成人每克粪内有此菌105～106个）及温血动物的粪便内，可作为粪便污染指示菌。优点：有芽孢，对氯等消毒剂及外界不良环境具有较强的抵抗力，能在水中较长久存在，尤其合用于在具有有毒物质（如氯等）的水体中检测是否有过粪便污染。5.蛭弧菌蛭弧菌（Bdellovibrio）是一类以捕食细菌为生的寄生菌，依托对宿主菌的寄生和裂解使本身得到生长繁殖。当水体受到粪便污染时，可供蛭弧菌寄生的宿主增长，蛭弧菌因而大量繁殖，数量增长，从而对污染起到指示作用。生长繁殖需要一定的时间，故其对污染的指示有一种滞后期。当蛭弧菌数量升高后，可长时间连续较高的水平。可用蛭弧菌联合大肠菌群表达水体所受粪便污染的新旧或区别污染是否连续。三、其他指示微生物致病菌的指示菌：1.沙门氏菌（Salmonella）种类繁多，有些对人和动物都有致病力，如肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌等，能引起人类伤寒症、急性胃肠炎和败血症等，经粪—口传播，污染食品、药用动物脏器等，在口服用药和食品中不得检出。2.志贺氏菌（Shigella）引起人类细菌性痢疾，经粪--口传播，被要求为食品卫生指示菌，不得检出。3.铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）也称绿脓杆菌，为革兰氏阴性具有单根鞭毛的细小杆菌，存在于人畜粪便及污水中，可作为粪便污染指示菌。此菌还存在于人的皮肤和上呼吸道，是常见的条件致病菌，它常被作为药物、化装品、游泳池水的卫生指示菌。如我国眼科制剂、外伤用药、化装品中不得检出铜绿假单胞菌。4.金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）为革兰氏阳性，排列呈葡萄状的球菌，存在于正常人的皮肤、鼻咽部和肠道及家畜的皮肤和肠道。侵入破损的皮肤和黏膜，可引起局部化脓性炎症，严重者可引起败血症；有些菌株污染食品可产生肠毒素，达成一定剂量时可引起食物中毒。在食品、化装品、外用药物以及游泳池水等的监测中都被作为主要的卫生指示菌之一，如我国要求1g（m1）化装品中不得检出金黄色葡萄球菌。5.链球菌属（Streptococcus）对人体致病性较强者为化脓性链球菌，在外环境中生存能力较强。能够经过飞沫气溶胶、污染的食品等传播，引起化脓性感染和食物中毒。在我国许多食品卫生原则中都要求不得检出6.破伤风梭菌（Clostridiumtetani）属专性厌氧梭状芽孢杆菌属，广泛分布于泥土中。经过外伤后经皮肤感染，在坏死组织中厌氧繁殖，产生外毒素致病。以根、茎类植物为原料的药物易受破伤风梭菌污染，外用药，尤其是用于深部组织、创伤、溃疡的外用药不得检出。肠道病毒的指示微生物

脊髓灰质炎病毒噬菌体四、有毒物质的检测原理：选择微生物的生理指标（如细胞生长、呼吸、酶活性等），根据待测物影响或克制这些指征的程度来判断毒性的强度。采用的评价指标多为EC50（50％effectiveconcentration，半数有效浓度）或IC50（50％inhibitionconcentration，半数克制浓度）值，即计算影响或克制微生物某种正常生理指标值50％所需的待测物浓度。不同措施和试验室的检测成果易于比较。一般觉得EC50或IC50可与哺乳动物试验的LC50进行类比。1.发光细菌—细菌生物发光克制试验（microtox）一类能产生生物发光的细菌，统称为发光细菌（luminousbacteria）。目前发觉的发光细菌分属弧菌属、发光杆菌属和异短杆菌属。发光细菌均为革兰氏阴性、兼性厌氧菌。（0.4-1.0）×（1.0-2.5）μm，无孢子、荚膜，有端生鞭毛一根或数根，最适生长温度为20-30℃，pH6-9，培养基中NaCl浓度2％-40%。试验原理：生物发光是发光细菌生理情况的一种反应，在生长对数期发光能力最强。当环境条件不良或有毒物存在时，因为细菌荧光素酶活性或细胞呼吸受到克制，发光能力受到影响而减弱，其减弱程度与毒物的毒性大小和浓度成一定百分比关系。经过敏捷的光电测定装置，检验在毒物作用下发光菌的光强度变化，能够评价待测物的毒性。人们筛选对环境敏感而对人体无害的菌株，用以迅速监测环境毒物。美国，Beckman企业，将毒性测定过程原则化，并命名称为“Microtox”。目前该措施是国际通用、使用最为广泛的污染物毒性微生物学检测措施。毒性测定：向测试管中定量加入菌液和样品，以苯酚作为阳性有机毒物对照、Zn2+作为阳性无机毒物对照，蒸馏水为阴性对照。在15℃条件下培养5min或15min后（目前国际上测定时间有这两种方式），即可经过生物发光光度计直接读出或扫描5min或15min光量克制百分率（inhibitionrate，IR），计算克制细菌发光强度50％所需的待测物浓度（IC50）。2.硝化细菌——硝化作用克制试验（nitrificationinhibitiontest）亚硝化细菌，如亚硝化单胞菌属（Nitrosomkonas）；硝化细菌，如硝化杆菌属（Nitrobacter）。硝化作用易受到外界环境原因的影响；重金属、农药、有机污染物等能够经过克制硝化作用的酶类（如氨单加氧酶、经氨氧化酶、亚硝酸氧还酶），造成亚硝化或硝化细菌对底物的利用能力或产物生成量下降；建立硝化作用克制试验，经过测量底物或产物的变化来检测污染物毒性作用的程度。废水稀释比例废水浓度对硝化作用抑制曲线硝化抑制率3.藻类——生长克制试验（algoegrowthinhibitiontest）试验原理：藻类对水体污染反应十分敏感。例如，在河流中，当水温为20℃时，硅藻占优势，30℃时，绿藻占优势，当热污染使水温升高到35-40℃时，则蓝细菌（蓝藻）占优势。水体自净过程，水中无机氮化合物含量不断增长，在光照和温度合适时，藻类生长量亦相应增长；反之，在具有毒物的水中，因为毒物的克制作用，使藻体叶绿素浓度降低，影响了光合作用，藻类生长量亦相应降低。水质生物检测中比较常用的有硅藻、栅藻、小球藻等；因为生长繁殖迅速，对水质变化敏感，能够经过测定水中这些藻类的生长量来测定水质污染情况或物质毒性程度。测定藻类生长量的措施有下列几种：①藻体生长量；②释出氧量；③摄取14C量；④细胞DNA及ATP测定。S1S2S3S4时间Lg生物量藻类毒性试验的生长曲线（待测物浓度S4＞S3＞S2＞S1）4.原生动物——微尺度群落级毒性试验（microscalecommunity-leveltoxicitytest）又称微型生物群落（microbialcommunity）监测法，广泛地用于水环境的毒性检测与评价。所涉及的微生物种群不止一种，涉及细菌、真菌、原生动物、藻类、小型轮虫等。其中最具特色的是原生动物，将其归于此类。试验原理正常条件下自然界水环境的微型生物群落种类、分布与构成都有一定规律。在外界环境原因的干扰下，群落的平衡被破坏，构造特征也随之变化。经过分析有关的微型生物群落构造参数，即可判断水环境的质量情况或污染物质的毒性特征。该措施突破了单一微生物种类用于毒性检测的不足。因为微型生物群落中有生产者、分解者、消费者，构成了一种复杂的食物网，所以检测的成果有很强的生态学意义。该措施中最成熟、应用最广泛的是PFU（Polyurethanefoamunit，聚氨酯泡沫塑料块）法。聚氨酯泡沫塑料块，可浸没于水体，能搜集到85％的种类，具有环境真实性；在一定时间内，PFU中原生动物种群构成会达成平衡，而有害污染物会破坏这一平衡。经过比较试验组和对照组的群落构造和功能参数，即可评价水体质量与污染程度。活性污泥毒性检测法1.脱氢酶活性试验（dehydrogenaseactZvitytest）脱氢酶类能使被氧化有机质的氢原子活化并传递给特定的受氢体，反应活性污泥对污水中有机质的氧化分解能力；有毒物质的存在会使脱氢酶类活性降低并影响活性污泥的效果。可经过指示剂的还原变色速度来拟定脱氢酶活性，以判断毒性物质的作用强度。2.呼吸克制试验（respiratiioninhibitiontest）微生物在进行有氧呼吸、分解有机质的过程中会消耗氧，产生CO2，所以测定呼吸速率能够反应活性污泥中微生物的代谢速率，对分析废水生物可降解性有主要意义。废水中有毒物质能够克制微生物的呼吸，使其耗氧量和CO2产生量下降，下降的程度与毒性物质的浓度和强度有关。abcda：无毒，能被利用b：无毒，不能被利用c：有毒，能被利用d:有毒，不能被利用基质浓度污泥相对耗氧速率与废水毒性、可降解性的关系100%相对耗氧速率特点：（1）简便：与哺乳动物的喂养相比，微生物培养繁殖易掌握和控制，检测措施也很简捷。（2）敏捷：许多微生物的代谢活动对毒物干扰十分敏感，能够反应痕量毒物的效应。（3）迅速：微生物细胞的繁殖速度快，世代时间短，所以检测时间较哺乳动物试验短。（4）经济：微生物菌株易于保藏、复苏，且许多检测手段已自动化，所以试验成本较低。五、致突变性污染物的微生物检测20世纪70年代开始环境致突变物（mutagen）、致癌物（carcinogen）的生物学试验；1.鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶（Ames试验）美国Ames教授，1975年，致突变性测试法，也称Ames致突变试验。检测DNA碱基序列是否发生变化即基因突变的一种措施。原理：Ames试验利用鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）的组氨酸营养缺陷型菌株发生回复突变的性能来检测物质致突变性的措施。常用的组氨酸缺陷型沙门氏菌有5种，均各具有控制组氨酸合成的基因。当培养基中不具有组氨酸时它们不能生长。当受到某些致突变物作用时，菌体内DNA特定部位发生基因突变而回复为野生型菌。培养基中不具有组氨酸时该菌也能生长。哺乳动物微粒体酶：混合功能氧化酶系，其中涉及细胞色素P450、NADPH—细胞色素P450还原酶、细胞色素b5、NADH—细胞色素b5还原酶、芳烃经化酶、环氧化物水化酶及磷脂等；P450最为主要：一是降解作用，使化学物变为低毒或无毒物排出；二是激活作用，使化学物转化为具有亲电子性质，造成毒性增强，成为致突变物或终致癌物。又称鼠伤寒沙门氏菌／哺乳动物微粒体试验法（Salmonellatyphimurium/mammalianmicrosometest）。2.发光细菌试验利用发光细菌暗变异株恢复发光的现象，可对多种遗传毒性物质进