激光共聚焦显微镜技术

激光共聚焦显微镜技术在生物医学中的应用概况：激光共聚焦显微镜（LSCM）是八十年代问世的一种新型分析仪器，因为其高辨别率，高敏捷度，高放大率等特点，在细胞水平上能作多种功能测量和分析，成为分析细胞学的主要研究工具；激光扫描共焦显微镜是在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置，共轭聚焦装置和检测系统而形成的新型显微镜；它对活细胞分层扫描后得到光学切片，可进行细胞三维重建。测量分析细胞形态学参数和荧光强度；利用荧光探针标识LSCM能够对细胞内微细构造和离子的动态变化进行定性、定量、定时和定位分析；LSCM能够进行显微手术，细胞分选，细胞胞间通讯和膜的流动性等测量。它的应用前景非常广泛，将为生物医学和生命科学领域的科研工作提供新的手段。LSCM的发展简况：

1971年美国Davidovits和Egger发明了以激光为光源的透镜扫描系统，1978年Sheppard等推出了载物台扫描装置。1979年有了样品扫描装置，1980年Koestert等简介了镜扫描系统，1983到1986年，Aslund和Carlsson等简介了双镜扫描系统和共轭聚焦成象系统。1984年第一台LSCM实用产品问世，十数年来LSCM的应用有了飞速发展。产品主要来自四家企业，德国的Zeiss和Leica企业，日本的Olympus和Nikon企业。LSCM的基本原理一般光学显微镜使用的卤素灯光源为混合光，光谱范围宽，成象时样品上每个照光点均会受到色差影响以及由照射光引起的散射和衍射的干扰，影响成象质量；LSCM的光源为激光，单色性好，基本消色差，成象聚焦后焦深小，纵向辨别率高，可对样品作不同深度的层扫描和荧光强度测量，不同焦平面的光学切片经三维重建后能得到样品的三维立体构造，这种功能被形象的称为“显微CT”。利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光经过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，所以被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。LSCM的构造特点LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中以便灵活地进行。显微镜光学系统

显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成象质量。一般有倒置和正置两种形式，前者在活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。显微镜物镜应选用大数值孔径平场复消色差物镜为好，有利于荧光的采集和成象的清楚。物镜组的转换，滤色片组的选用，载物台的移动调整，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。多功能显微镜以德国的蔡司Zeiss和莱卡Leica的产品为好，也常用日本的尼康Nikon或奥林巴斯Olympus产品。LSCM的构造特点扫描装置LSCM使用的扫描装置有两类，台扫描系统和镜扫描系统。目前也有两者结合使用的仪器。台扫描经过步进马达驱动载物台，位移精度可达0.lμm，能够有效地消除成象点横向象差，使样品信号强度不受探测位置的影响，可精拟定位定量地扫描检测视野中每一物点的光强度，缺陷是载物台机械移动、图象采集速度较慢。镜扫描有双镜扫描和单镜扫描两种，通转镜完毕对样品的扫描。因为转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围，图象采集速度大大提升，512×512画面每秒可达4帧以上，有利于那些寿命短的离子作荧光测定，但因光路略有偏转会对通光效率和象差有所影响。扫描系统的工作程序由计算机自动控制。

LSCM的构造特点激光光源

LSCM使用的激光光源有单激光和多激光系统。氪氩离子激光器是可见光范围内使用的多光谱激光，发射波长488nm、568nm和647nm分别为蓝光、绿光和红光，大功率氩离子激光器是紫外和可见光混合激光器，发射波长为351－364nm、488nm和514nm分别为紫外光、蓝光和绿光，单个激光优点是安装以便，光路简朴，但价格较贵并存在不同激光之间的光谱竞争和色差校正问题。多激光器系统在可见光范围使用氩离子激光器，发射波长为

488nm和514nm的蓝绿光，氦氖激光器发射波长为633nm的红光，紫外光选用氩离子激光器，波长为351－364nm。其优点是各谱线激光单独发射，不存在谱线竞争的干扰，调整以便。检测系统

LSCM为多通道荧光采集系统，光路上要求至少有三个荧光通道和一种透射光通道，如有第四荧光通道愈加好，可对物体进行多谱线激光激发，样品发射荧光的探测器为感光敏捷度高的光电倍增管PMT。LSCM的生物医学应用

荧光检测制作和分析有荧光标识的样品是既费时又费力的工作。采用多荧光，您能够使用多种标识同步研究细胞构造。另外，多荧光试验是直接研究分子和其他细胞成份之间关系的唯一工具。GL-50PD-L1PD-L2CD83CD80CD86

CD40MergeCD40Merge

B7H4LightCD25CD132Merge(CD25CD132)Pearsonr=0.80

CD25CD122

Merge(CD25CD122)Pearsonr=0.79细胞定量荧光测定

显微荧光光度计因为显微镜和激发光源的限制成象模糊，只能测定细胞内的荧光总量，有一定的误差。LSCM以激光为光源，对细胞分层扫描，单独测定，经积分后能得到细胞荧光的精拟定量，反复性极佳。它适于活细胞的定量分析，可测定细胞内溶酶体、线粒体、DNA含量、RNA含量、酶和构造性蛋白质等物质含量和分布，常用于原位分子杂交，肿瘤细胞辨认，单个活细胞水平的DNA损伤及修复的定量分析。它适于迅速高敏捷度测量，降低光粹灭的影响，在定量免疫荧光测定方面应用广泛，如作多种肿瘤组织切片抗原体现的定量分析，监测肿瘤有关抗原体现的定位定量信息，监测药物对肌体免疫功能的作用，监测本身免疫性疾病的多种抗原及药物对肌体免疫功能的作用，监测细胞结合和杀伤的形态特征并作定量分析等。细胞定量荧光测定可选用单荧光、双荧光和三荧光方式，能自动测定细胞面积，平均荧光强度，积分荧光强度及形状因子等多种参数。

细胞的三维重建

一般荧光显微镜辨别率低，显示的图象构造为多层面的图象迭加，构造不够清楚。LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A／D转换后作为二维数组贮存。这些数组经过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色图象处理，双色图象处理，组合成细胞真实的三维构造。旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可不同的断面观察细胞内部构造，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。经过模拟荧光处理算法，能够产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。经过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析，染色体分析，细胞程序化死亡的观察，细胞内细胞质和细胞器的构造变化的分析和探测等方面。Cellculture,3Dshadowprojectionshowingtightjunctions(red)andcytoskeletonstructures(green)Mitose-Tubulin(FITC),DNA(PJ)

细胞内钙离子PH值和其他离子的

动态分析

经过Indo－1、Fluo－2、Fluo－3、Calcium

green、SNARF等多种荧光探针，可对细胞内钙离子、钠离子及PH值等作荧光标识并对它们进行比率值和浓度梯度变化测定。因为细胞内钙离子为传递信息的第二信使，对细胞生长分化起着主要作用，经过单标识或双标识对细胞内钙离子和其他离子的荧光强度和分布精确测定，测定样品达成毫秒级的迅速变化。借助光学切片功能能够测量样品深层的荧光分布以及细胞光学切片的生物化学特征的变化。经过不同步间段的检测可测定细胞内离子的扩散速率，了解它对肿瘤开启因子、生长因子等刺激的反应。细胞内离子测量广泛用于肿瘤研究、组织胚胎学、细胞生物学和药理学等领域。管状唾腺切片中钙浓度的变化用F/F0来展示。F/F0则用假色来表达，兰色表达钙含量低，红色表达钙含量高。荧光光漂白恢复（FRAP和FLIP）

什么是FRAP？FRAP(光漂白后荧光恢复)就是在光漂白后对样本拟定区中的荧光恢复。FRAP是由没有漂白的荧光团由周围进入漂白区FRAP的运动引起的。FRAP用于测量2-维或3-维分子运动的力度。分子运动涉及膜或活细胞内用荧光标明的分子的扩散、转移或其他类型的运动。什么是FLIP？FLIP（光漂白中的荧光损失）是一种邻近反复漂白区的被定义区域内荧光的降低或消失。与FRAP一样，FLIP被用来测量膜或活细胞内分子运动的力度。FRAP原理在进行FRAP试验时，一种区域（如用荧光作标志的细胞表面）用低激光强度成像。所以，高强度鼓励光脉冲被用来对定义的区域进行强烈漂白，如衍射限制点、小漂白ROI、视场内平行光带的直线型。最终，在漂白区域的恢复时间过程采用模糊鼓励激光束来监控。成果是，FRAP阐明任何类型的荧光分子运动（被动的，如扩散；主动的，如移动。）恢复时间（半恢复时间）表白了这种移动性，如扩散时间的速度。例子（一）EGFP-expressingmyoblastcellline

Experiment:Bleachingofthenucleus(ROI1)bypixel-preciseAOTFcontrolisfollowedbyslowEGFPflow-backfromthecytoplasm.Result:EGFPcanpassthenuclearmembrane(thenuclearporecomplex).例子（二）Experiment:Bleachingofpartsofthenuclearmembraneatt=0min

Result:Rapidrecoveryofmutantemerin-GFPfluorescenceinthebleachedareaduetohighmobilityofthemutantprotein;lowermobilitiyofthewildtypeemerin-GFPproteinbecauseofinteractionwithotherproteins.Emerin-GFPtransfectedcells,top:wildtypeemerin;bottom:emerinmutant

例子（三）LivingculturedcellexpressingGFPandaYFP-SHPfusionprotein

Experiment:Bleachingofnuclearfluorescence;InordertoseparateGFPandYFPsignals,imagedatawereacquiredasseriesofLambdaStacksandsubjectedtoEmissionFingerprinting.Intheresultingimageseries,GFPandYFParedisplayedingreenandred,respectively.Result:GFPdistributesthroughoutthecell,whileYFPconcentratesinthecytoplasm.BleachingofnuclearGFP(ROI1)isfollowedbyslowrecoveryindicatingGFPdiffusionthroughnuclearpores.FRET什么是FRET？FRET就是采用非放射性措施，在供体和受体相互靠得很近（1-10nm）时，将光子能从一种