临床免疫学实验：4.5 ELISA法检测血清抗结核抗体

免疫标记技术定义：

将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。分类：放射免疫测定法：131I，32P免疫荧光技术：FITC，PE免疫酶测定法：HRP，AP

用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性荧光素：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、罗丹明（红色荧光）放射性同位素：125I、131I酶：辣根过氧化物酶、硷性磷酸酶免疫荧光检测法（IFA）放射免疫检测法（RIA）酶免疫检测法（EIA）免疫标记技术液相（ELISA）、固相（免疫组化技术）酶免疫测定法

(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。

辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，可定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值分类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。酶联免疫吸附试验

(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。1.定义2.分类直接法（directELISA）：间接法（IndirectELISA）：将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未知抗体双抗体夹心法（SandwichELISA)：竞争法（CompetitiveELISA)：

将特异性抗原与固相载体相连,加入合适的抗体（待测标本）,使之与抗原结合,漂洗时不被冲走。结合的抗体用酶标抗人IgG进行检测。ELISA间接法--主要用于检测抗体间接ELISA原理（以间接ELISA为例）：显色1、已知抗原吸附于载体表面2、加待检物无抗体与抗原结合3、加酶标抗Ig与抗体结合4、加酶作用的底物产生颜色1、已知抗体吸附于载体表面2、加待检物有抗体与抗原结合3、加酶标的抗Ig抗体4、加酶作用的底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤间接法测抗体-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+实验步骤：显色封闭包被Ag洗涤加待测血清Ab洗涤加酶标抗抗体洗涤终止酶标仪测OD值(在492nm波长下)固相聚苯乙烯Ag或Ab吸附到固相上的过程,称为包被

常用酶及其底物常用底物：邻苯二胺(OPD)：反应显黄色，应避光，致癌性。终止后显棕黄色四甲基联苯胺(TMB)：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性,但水溶性差。终止后显黄色常用底物：对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。AP灵敏性高于HRP，但不易获得纯品，且稳定性低于HRP、价高，故应用不如HRP普及。1.辣根过氧化物酶(HRP)2.碱性磷酸酶(AP)HRP的底物系统

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP邻苯二胺(OPD),反应中作为供氢体H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高

有色产物供氢体受氢体OPD反应后显黄色，加浓硫酸终止反应后呈棕黄色

HRP的常见底物：OPD

酶和酶作用底物酶标仪实验内容：

ELISA间接法测定抗结核抗体实验材料PPD(结核杆菌蛋白衍生物)——

抗原抗结核抗体——

待测抗体（待测血清）HRP标记羊抗人IgG——

二抗包被缓冲液：0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液CB：配制100mlNa2CO30.16克，NaHCO30.29克，加双蒸水至100ml洗涤液：含0.05%Tween20的0.01MpH7.4PBS:配制1500mlNaH2PO4.2H2O0.45克，Na2HPO4.12H2O4.35克，NaCl11.4克，加双蒸水至1500ml底物缓冲液：pH5.0磷酸盐—柠檬酸缓冲液:配制50mlNa2HPO4.12H2O1.85克，柠檬酸0.51克加双蒸水至50ml底物：OPD20mg，底物缓冲液50ml，30%H2O2100μL:临用时配实验方法1.抗原的处理：PPD冻干粉剂用包被缓冲液稀释至10μg/ml2.包被抗原：取酶标板，加入抗原稀释液：100μL/孔（10μg/ml）4℃，湿盒内，过夜取出包被好抗原的酶标板，甩干孔内液体注满洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，1min/次3.加待测血清标记各孔，加入相应血清100μL/孔123待测2待测1待测34.加酶标二抗：37℃，湿盒内，30min甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，1min/次各孔加入酶标二抗100μL/孔37℃，湿盒内，30min5.显色：甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，1min/次加入新鲜配制底物100μL/孔室温2min,显色后各孔加100μL/孔