化学生物学-第三章 酶

Enzyme第三章

酶

Enzyme1一、酶的概念目前将生物催化剂分为两类酶、核酶（脱氧核酶）酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质。2酶学研究简史公元前两千多年，我国已有酿酒记载。一百余年前，Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。1877年，Kuhne首次提出Enzyme一词。1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵。1926年，Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。1995年，JackW.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。3酶是生物催化剂酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子，所以又称为生物催化剂(biocatalysts）

绝大多数的酶都是蛋白质。酶催化的生物化学反应，称为酶促反应（Enzymaticreaction）。在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物（substrate）。4二、酶的分类与命名

酶的分类根据酶所催化的反应类型，按照国际酶学委员会，将酶分为六大类：51氧化-还原酶Oxidoreductase氧化-还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。672转移酶Transferase转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。

例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。893水解酶hydrolase水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：10114裂解酶Lyase裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶及脱氨酶等。ABA+B125异构酶Isomerase异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。

常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类136合成酶LigaseorSynthetase合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。A+B+ATP+H-O-H===A

B+ADP+Pi

例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸+CO2

草酰乙酸14三、酶的化学本质一、蛋白质二、核酸15单体酶(monomericenzyme)：由单条肽链构成,仅具有三级结构的酶。寡聚酶(oligomericenzyme)：由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶。多酶体系（multienzymesystem)：由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。16(multienzymesystem)：由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。多酶体系17酶的分子组成蛋白质部分：酶蛋白(apoenzyme)辅助因子(cofactor)金属离子小分子有机化合物全酶(holoenzyme)单纯酶(simpleenzyme)结合酶(conjugatedenzyme)18*各部分在催化反应中的作用酶蛋白决定反应的特异性辅助因子决定反应的种类与性质金属酶(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。

金属激活酶(metal-activatedenzyme)

金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密。19金属离子的作用稳定酶的构象；参与催化反应，传递电子；在酶与底物间起桥梁作用；中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。小分子有机化合物的作用在反应中起运载体的作用，传递电子、质子或其它基团。20小分子有机化合物在催化中的作用

辅酶前体维生素功能全酶NAD+（辅酶I）NADP+(辅酶II)B5（烟酰胺）传递质子和电子脱氢酶FAD和EMN（黄素辅酶）B2（核黄素）传递质子和电子脱氢酶TPP（硫胺素焦磷酸酯B1（硫胺素）基团转移脱羧酶四氢叶酸(THFA)B11(叶酸)一碳基团转移合成酶辅酶AB3(泛酸)酰基转移合成酶生物素B7(生物素)CO2转移羧化酶磷酸吡哆素B6（吡哆素）转氨基转氨酶辅酶B12B12（钴维素）异构化变位酶硫辛酸传递氢和转移乙酰基丙酮酸脱氢酶系泛醌（辅酶Q）传递质子和电子氧化-还原酶21辅助因子分类（按其与酶蛋白结合的紧密程度）

辅酶(coenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。

辅基(prostheticgroup):与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。22辅酶的作用1参与基团的转移:氨基------磷酸吡哆醛(VitB6)羧基------生物素(biotin)、维生素K一碳单位------四氢叶酸(folicacid)甲基------维生素B12酰基-----辅酶A、硫辛酸23辅酶的作用2质子（氢原子）转移:FAD+

FADH2NAD+

NADH+H+NADP+

NADPH+H+24辅酶在酶促反应中的作用特点辅酶在催化反应过程中，直接参加了反应。每一种辅酶都具有特殊的功能，可以特定地催化某一类型的反应。同一种辅酶可以和多种不同的酶蛋白结合形成不同的全酶。一般来说，全酶中的辅酶决定了酶所催化的类型（反应专一性），而酶蛋白则决定了所催化的底物类型（底物专一性）。25四、酶的结构与功能的关系26酶的活性中心酶的活性中心27必需基团(essentialgroup)酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的化学基团。28活性中心内的必需基团

结合基团(bindinggroup)——与底物相结合催化基团(catalyticgroup)——催化底物转变成产物活性中心外的必需基团位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。29或称活性部位(activesite)，指必需基团在一级结构上可能相距遥远，但在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。酶的活性中心(activecenter)30活性中心内的必需基团结合基团(bindinggroup)与底物相结合催化基团(catalyticgroup)催化底物转变成产物位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。活性中心外的必需基团31结合部位Bindingsite酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。32酶与底物的结合部位33催化部位catalyticsite酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化位点。通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心。结合部位决定酶的专一性，催化部位决定酶所催化反应的性质。34酶活性中心的必需基团主要包括：亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。3536五、酶促反应的特点

TheCharacteristicandMechanismofEnzyme-CatalyzedReaction

37酶与一般催化剂的共同点在反应前后没有质和量的变化；只能催化热力学允许的化学反应；只能加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点。38（一）酶促反应具有高效性

一、酶促反应的特点酶的催化效率通常比非催化反应高108～1020倍，比一般催化剂高107～1013倍。酶的催化不需要较高的反应温度。酶和一般催化剂加速反应的机理都是降低反应的活化能(activationenergy)。酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能。39反应总能量改变

非催化反应活化能

酶促反应活化能

一般催化剂催化反应的活化能

能量

反应过程

底物

产物

酶促反应活化能的改变活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。40一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物。酶的这种特性称为酶的特异性或专一性。*酶的特异性(specificity)（二）酶促反应具有高度的特异性41分类：绝对特异性(absolutespecificity)：只能作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物

。相对特异性(relativespecificity)：作用于一类化合物或一种化学键。立体结构特异性(stereospecificity)：作用于立体异构体中的一种。旋光异构特异性几何异构特异性42立体异构特异性旋光异构特异性：例如：

L-乳酸脱氢酶丙酮酸L-乳酸

D-乳酸脱氢酶丙酮酸D-乳酸43

酵母中的酶D-型葡萄糖发酵

酵母中的酶L-型葡萄糖发酵

L-精氨酸酶L-精氨酸L-鸟氨酸+尿素D-精氨酸44立体异构特异性几何异构特异性延胡索酸酶反丁烯二酸苹果酸延胡索酸酶顺丁烯二酸45（三）酶促反应的可调节性对酶生成与降解量的调节酶催化效力的调节通过改变底物浓度对酶进行调节等酶促反应受多种因素的调控，以适应机体对不断变化的内外环境和生命活动的需要。其中包括三方面的调节。46六、酶促反应的机理（一）锁－匙学说认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样47六、酶促反应的机理诱导契合学说*诱导契合假说(induced-fithypothesis)酶底物复合物

E+SE+PES

酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称为酶-底物结合的诱导契合假说。48E+SP+EES能量水平反应过程

G

E1

E249酶-底物复合物的形成在底物S与酶E结合之前，二者均处于自由运动状态，在结合过程中，由于底物与酶分子的相互作用产生结合能，结合后，形成高度有序、底熵的复合物50脱溶剂化作用

在酶-底物复合物ES形成过程中，酶分子活性中心结合的水分子和底物分子结合的水分子相继发生脱溶剂化作用，脱溶剂化作用增加了ES复合物的能量，使其更活泼而容易反应。

51静电不稳定作用

当底物进入酶的活性中心时，底物分子的带电荷基团被迫与酶活性中心的电荷相互作用，导致静电不稳定作用，底物分子发生扭曲、形变，从而引起反应加速进行。

5253（三）与酶的高效率催化有关的机制：1.邻近效应与定向排列

2.多元催化：酸碱催化

3.表面效应：防止底物与酶之间形成水化膜

541.趋近效应和定向效应底物在活性中心聚集，局部微环境浓度

催化基团定向催化反应55接受质子：碱提供质子：酸酶活性中心的某些基团可作为质子的供体或受体，从而对底物进行酸碱催化如组氨酸的咪唑基,解离常数为6.0，在生理pH下酸碱形式均可存在，很活跃

酸碱催化可参与多种反应，如多肽的水解、酯类的水解、磷酸基的转移2.多元催化（multielementcatalysis）56

酶活性中心疏水性“口袋”

防止底物与酶之间形成水化膜

有利底物与酶密切接触3.表面效应(surfaceeffect)57七、酶促反应动力学KineticsofEnzyme-CatalyzedReaction

58概念研究各种因素对酶促反应速度的影响，并加以定量的阐述。影响因素包括有酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。※研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。59一、底物浓度对反应速度的影响单底物、单产物反应酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速度底物浓度远远大于酶浓度研究前提E+Sk1k2k3ESE+P60在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。61当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。[S]VVmax62随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。[S]VVmax63当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加,达最大速度;反应为零级反应[S]VVmax酶被底物饱和64底物对酶促反应的饱和现象：65（一）米－曼氏方程式中间产物

酶促反应模式——中间产物学说E+Sk1k2k3ESE+P66※1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelisequation)。[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常数(Michaelisconstant)

ＶVmax[S]Km+[S]＝──67米-曼氏方程式推导基于两个假设：E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速率取决于慢反应。即

V＝k3[ES](1)S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。682．稳态的概念介入米氏方程式的推导过程

稳态：是指ES的生成速率与分解速率相等，即[ES]恒定。k1([Et]－[ES])[S]＝k2[ES]+k3[ES]k2+k3＝Km

（米氏常数）k1令：则(2)变为:([Et]－[ES])[S]＝Km[ES](2)＝([Et]－[ES])[S]k2+k3[ES]k1整理得：69将(3)代入(1)得k3[Et][S]Km+[S](4)V＝────当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即[Et]＝[ES]，反应达最大速率Vmax＝k3[ES]＝k3[Et](5)[ES]＝───[Et][S]Km+[S](3)整理得:将(5)代入(4)得米氏方程式：Vmax[S]Km+[S]V＝────70当V=Vmax/2时,

Km值的推导Km＝[S]

∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。2＝Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2ＶVmax[S]Km+[S]＝──71（二）Km与Vmax的意义

Km值①Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。②意义：a)

Km是酶的特征性常数之一；

Km只与酶的性质有关,与酶的浓度无关b)

Km可近似表示酶对底物的亲和力（反比）c)

同一酶对于不同底物有不同的Km值。

确定最合适底物或天然底物72Km是酶的特征性常数

在酶的结构、溶液pH、温度等条件不变的情况下，酶促反应底物的Km不因反应中酶浓度的改变而不同。

同一酶对其所催化的不同底物有不同的Km；不同酶对同一底物也有其各自的Km。Km的范围多在10-6～10-2mol/L之间。

736.0

10

3己-N-乙酰2葡萄糖胺溶菌酶2.5

10

2H2O2过氧化氢酶4.0

10

3D-乳糖

-半乳糖苷酶2.5

10

3N-苯甲酰酪氨酰胺1.08

10

1甘氨酰酪氨酰甘氨酸胰凝乳蛋白酶2.6

10

2HCO3

碳酸酐酶1.5

10

3D-果糖5

10

5D-葡萄糖4

10

4ATP己糖激酶（脑）

Km（mol/L）底物酶

一些酶的底物的Km

74Km在一定条件下可表示酶对底物的亲和力

k1Km

=k2

+

k3当k3<<k2时，Km

k2/k1。即相当于ES分解为E+S的解离常数（dissociationconstant,Ks）。此时，Km代表酶对底物的亲和力。

Km越大，表示酶对底物的亲和力越小；Km越小，表示酶对底物的亲和力越大。

75Km最小的底物大多数是此酶的天然底物

如：己糖激酶对葡萄糖的Km1.5mmol/L对果糖的Km28mmol/L

所以葡萄糖为最适底物一种酶对每一种底物都各有一个特定的Km76

Vmax定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。意义：Vmax=K3[E]如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算酶的转换数(turnovernumber)，即动力学常数K3。77酶促反应动力学参数可用作图法求得

1．双倒数作图法是求取Vmax和Km的最常用方法

林-贝方程式（Lineweaver-Burkequation）

将米氏方程式两边取倒数，并加以整理，则得出米氏方程式的双倒数形式：V1=KmVmax[S]1+Vmax178直线在纵轴的截距等于1/Vmax，而在横轴上的截距为

1/Km

792．其他一些作图法也可较准确地求取Vmax和Km

海涅斯-沃尔弗作图法（Hanes-Wolffplot）

双倒数方程式两边同时乘以[S]

[S]V=KmVmax[S]+Vmax180直线的斜率等于1/Vmax，横轴截距为-Km

81伊迪-霍夫斯蒂作图法（Eadie-Hofsteeplot）

米氏方程式两边均除以[S]

V=[S]VmaxKmV82直线的斜率为-Km，直线的纵轴截距为Vmax

83二、酶浓度对反应速度的影响当[S]＞＞[E]，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。关系式为：V=K3[E]0V

[E]

当[S]>>[E]时，Vmax=k3[E]

酶浓度对反应速度的影响

84A：底物浓度曲线，其中，[E]1>[E]2>[E]3。从图中可知，[E]的变化不影响酶促反应的Km。B：反应速率对酶浓度作图，V与[E]呈直线关系。

85双重影响温度升高，酶促反应速度升高；温度升高10oC,反应速度增加一倍由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低。

三、温度对反应速度的影响酶活性0.51.02.01.50102030405060温度ºC温度对淀粉酶活性的影响

86最适温度

(optimumtemperature)：酶促反应速度最快时的环境温度。温血动物：35～40℃TaqDNA聚合酶：70～75℃

可耐受100℃高温此酶是从水生栖热菌Thermus

Aquaticus（Taq）中分离出的热稳定性DNA聚合酶，用于PCR反应。

87低温的作用:贮存生物制品、菌种等

低温时由于活化分子数目减少，反应速度降低，但温度升高后，酶活性又可恢复。临床上的低温麻醉减少组织细胞的代谢程度，使机体耐受手术时氧和营养物质的缺乏

88四、pH对反应速度的影响解离状态：蛋白质的极性基团辅助因子的荷电状态底物的解离状态

而不同的解离状态或直接影响酶与底物的结合,或影响酶的空间结构,从而改变酶的活力89最适pH(optimumpH)：酶催化活性最大时的环境pH。多数酶：7.0左右胃蛋白酶：1.8肝精氨酸酶：9.80酶活性pHpH对某些酶活性的影响胃蛋白酶淀粉酶

胆碱酯酶

246810选择合适的缓冲液保持酶的相对稳定和保持高活性90五、抑制剂对反应速度的影响酶的抑制剂(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。区别于酶的变性抑制剂对酶有一定选择性引起变性的因素对酶没有选择性91

抑制作用的类型不可逆性抑制(irreversibleinhibition)可逆性抑制(reversibleinhibition)：竞争性抑制(competitiveinhibition)非竞争性抑制(non-competitiveinhibition)反竞争性抑制(uncompetitiveinhibition)92(一)不可逆性抑制作用*概念抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活。

*举例有机磷化合物

羟基酶解毒------解磷定(PAM)重金属离子及砷化合物

巯基酶解毒------二巯基丙醇(BAL)

93有机磷化合物路易士气失活的酶羟基酶失活的酶酸巯基酶失活的酶酸BAL巯基酶BA