医学分子生物学-上课用-11.疾病产生的分子基础

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第十一章疾病产生的分子基础

MolecularBasisofDiseasesFormation

2基因结构与表达异常与疾病人类疾病如白血病、恶性肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病、心脑血管、高血压等的发生和发展都涉及到有关蛋白质及其复合物的结构、功能和相互作用异常。疾病的本质是蛋白质功能紊乱，是各种原因引起蛋白质质和量的改变。3疾病产生的分子机制

基因结构的改变；

受细胞调节因素或其他因素影响使基因表达方式改变；

外来的致病基因；

蛋白质翻译后加工及降解发生变化；第一节基因结构改变与疾病一、基因突变二、基因突变的遗传学效应三、结构基因变异导致的疾病四、调控序列变异导致基因表达水平变化5自发性复制错误碱基脱落或部分脱落活性氧簇（ROS）物理因素紫外线电离辐射化学因素烷化剂碱基类似物修饰剂DNADNA突变的原因病原生物基因的整合1.点突变是单个碱基的改变2.缺失是一个或多个核苷酸的丢失3.插入是一个或多个核苷酸的增加4.倒位是一段核苷酸序列方向倒转5.基因突变还分为配子突变与体细胞突变6.动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变一、基因突变的类型脆性X综合症强直性肌营养不良Huntington舞蹈病Friedreich共济失调症CCG拷贝数过度增加3’非翻译区CTG拷贝数过度增加编码区CAG拷贝数过度增加内含子CAA拷贝数过度增加8脆性X综合征“CCG”重复发生在FMR1（脆性X智力低下基因1）的5’非翻译区，拷贝数不稳定。8~50拷贝（正常人）52~200拷贝（携带者）200~1000拷贝（患者）9（一）遗传密码突变1.错义突变（missensemutation）2.无义突变（nonsensemutation）3.同义突变（consensemutation）5.移码突变（frame-shiftmutation)二、基因突变的遗传效应1.错义突变：指DNA改变后mRNA中相应密码子发生改变，编码另一种氨基酸，使蛋白质中的氨基酸发生改变。5’---UCUCAAUUUACG---3’AAAmRNA

LysSerGlnpolypeptide5’---UCUCAAUUUACG---3’AAGGluPheThrAAA（Lys）

GAA（Glu）

有些错义突变不影响蛋白质的生物活性，不表现出明显的表型效应。5’---TCTCAA3’---AGAGTTTTTACG---3’AAATGC---5’AATTTA2.无义突变：基因突变导致mRNA密码子变成了终止密码子，引起多肽链合成的终止。DNA

5’---TCTCAA3’---AGAGTTTTTACG---3’AAATGC---5’AATTAT5’---UCUCAAUUUACG---3’AAAmRNA

LysPheThrSerGlnpolypeptide5’---UCUCAAUUUACG---3’AAUStopSerGlnAAA（Lys）

UAA（Stop）3.同义突变：基因突变导致mRNA密码子改变，所编码的氨基酸不变。DNA

5’---TCTCAA3’---AGAGTTTTTACG---3’AAAAAATGC---5’TTT5’---TCTCAA3’---AGAGTTTTTACG---3’AAGAAATGC---5’TTC5’---UCUCAAUUUACG---3’AAAmRNA

LysPheThrSerGlnpolypeptide5’---UCUCAAUUUACG---3’AAGLysPheThrSerGlnAAA

AAG（Lys）突变改变了mRNA上的密码子读码框≠3xdNt移码突变GCUGCUGCUGCUGCUCUGCUGCUGAlaAlaLeu

LeuLeu

AlaAlaAlaDeletion

=3xdNt

±nx氨基酸GCUUGCUGCAUGCAU

GCUGCUGCAAlaAlaCysCysMetAlaAlaHis4.移码突变：单个或数个碱基的缺失或插入、基因片段的缺失或插入，导致突变点后的阅读框发生改变，从而引起氨基酸顺序的改变。14（二）基因突变影响hnRNA的剪接基因突变发生在hnRNA的一级结构上特定的剪接位点上，形成新的剪接位点或使正常剪接位点消失，导致hnRNA的剪接错误，产生异常的mRNA，最终产生异常的蛋白表达产物，改变疾病发生。15真核生物基因的剪接位点：由内含子的5′端“GT”和3′端“AG”，及内含子和外显子内的其它调控元件共同决定。外显子1内含子1外显子2外显子1外显子2外显子1内含子1外显子1hnRNA剪接?YesNo16例：家族性孤立性生长激素缺乏Ⅱ型遗传病由于GH-1基因的EXONⅢ上第5nt由G→A，破坏一个ESE，使EXONⅢ被跳过，而最终造成编码蛋白缩短，影响功能。17转入了人缺陷型的GH-1基因利用RNAi使导入基因沉默2007年18三、结构基因改变导致的疾病结构基因发生改变会改变蛋白质的一级结构，进而改变蛋白质的理化性质。19（一）蛋白质结构变化引起的疾病1.血红蛋白病(hemoglobinopathy)

是一组由于血红蛋白遗传缺陷引起的疾病。异常血红蛋白病：珠蛋白肽链结构异常；地中海贫血：珠蛋白肽链合成障碍血红蛋白(Hb)结构20血红蛋白病——镰刀形细胞贫血症GAGGTG2122基因突变类型异常Hb氨基酸变化临床特征错义突变HbShuangfengα27Glu→Lys(GAG→AAG)不稳定Hb病HbSβ6Glu→Val(GAG→GUG)镰刀型细胞贫血HbBibbaα136Leu→Pro(CUG→CCA)不稳定Hb病无义突变HbMckeesRocksβ145Tyr→终止(UAU→UAA)不稳定Hb病终止密码突变HbConstantSpringα142UAA→CAA(延长：142Gln---173)α-地贫血红蛋白病分子基础23基因突变类型异常Hb氨基酸变化临床特征密码子缺失HbGunHillβ91～95缺失不稳定Hb病密码子插入HbGradyα118与119间插入3个氨基酸无明显症状移码突变HbTakβ147UAA→ACUAA延长：Thr---158UAA不稳定Hb病融合突变HbLepore-Bostonδ87(Gln)-β116(His)β-地贫HbKenyaγ81(Leu)-β86(Ala)β-地贫血红蛋白病分子基础242.家族性高胆固醇血症

一种常染色体显性遗传疾病，特征为低密度脂蛋白(LDL)-胆固醇水平明显升高，可出现黄色瘤和动脉硬化症。

病因：LDL受体基因变异，肝脏表面特异性的LDL-受体数目减少或缺乏，导致肝脏对血循环中LDL-胆固醇的清除能力下降，进而引起血循环中LDL-胆固醇水平升高。2526（二）蛋白质合成量变化引起的疾病27人珠蛋白基因簇及珠蛋白基因结构28

珠蛋白基因的表达在时空上受到遗传因素的精确调控，表现为以下特点：组织特异性发育阶段特异性协同性291.α-地贫基因缺失类型α1α2正常基本正常αααα+轻度贫血α+α+轻度贫血αα0高度贫血α+α0HbBart’s综合征α0α0302.β-地贫类型β珠蛋白基因第17位密码子AAG(Lys)→TAG,发生无义突变,引起β0地贫;β珠蛋白基因的编码顺序内插入或缺失1、２、４或７个核苷酸，移码突变，造成β-珠蛋白肽链合成提前终止，而引起β0地贫。31四、调控序列变异导致基因表达水平变化

顺式作用元件的基因突变，会降低β珠蛋白基因的转录，使β珠蛋白合成减少，引起β+-地贫。TATA盒：-32（C→A)、-30(T→C)、-29(A→G)、-28(A→G)。CAAT盒：-101、-92、-88、-87、-86等位点的点突变。CAATTATACAPPolyA尾130311041051465′3′IVSⅠIVSⅡIS（一）β珠蛋白基因启动子突变32启动子和外显子1之间大于10kb的缺失;另一种是启动子和外显子1之间大于6kb的缺失。两种突变都使LDL受体基因的表达能力完全丧失。（二）LDL受体启动子变异33一些内含子的变异也会影响蛋白质的合成，使体内相应蛋白质含量减少或缺失。ApoB100基因内含子的第一个碱基会发生G→T突变，突变基因转录后生产的hnRNA，会影响ApoB100mRNA的正常剪切。34第二节细胞间异常信号导致基因

表达异常引起疾病

人体各细胞间通过激素、神经递质、旁分泌信号等保持细胞间的联系，调节彼此的代谢。基因表达也受到细胞间信号的调控。35甲胎蛋白(AFP)接受异常细胞增殖信号成为肝癌发生的重要因素。胚胎发育过程中，AFP增强子激活;出生后，AFP沉默子处于活化状态。异常细胞增殖信号的作用下,c-myc、c-fos、c-jun等癌基因表达异常增加，其表达产物与AFP基因顺式作用元件结合，激活AFP基因表达。AFP与细胞膜受体结合，影响TNF及其受体表达，导致肝癌细胞逃避免疫监视，并促进其生长。36粉尘刺激→肺支气管上皮、肺泡巨噬细胞→分泌TGF-β1→刺激成纤维细胞→促细胞分裂和ECM蛋白基因表达→ECM蛋白合成和分泌增加（各型胶原蛋白、IL-1、TNF等）→ECM病理性蓄积，矽肺发生尘肺：长期吸入大量含游离二氧化硅粉尘引起的以肺纤维化为主要病变的疾病37第三节细胞内因素导致基因

表达异常引起疾病异常的细胞内信号持续高血糖引起的糖尿病心肌病高血糖→DAG↑→⊕PKC激活→⊕ACE活化→AngⅡ↑→心肌重塑、心肌肥大。38

异常的DNA甲基化hCG5´转录起始区低甲基化→非滋养层细胞hCG↑→与受体结合→⊕激活cAMP信号转导途径→恶性肿瘤发生↑39ProteinscomplexedwithDNAallowformore“open”structure;canbetranscribed….Methylationleadstochangeinchromatinstructure;morecondensedstateistranscriptionallyinactive…genesare“off”

…40人绒毛膜促性腺激素(hCG)在妊娠早期维持黄体功能、促进妊娠进行和胎儿性别分化等；肿瘤细胞中，hCG基因5’转录起始区发生去甲基化或低甲基化，形成非滋养层细胞中异位表达，具有类似与生长因子作用，激活cAMP旁路信号途径，独立地调节肿瘤细胞增殖、分化和生长。41第四节翻译后加工运输障碍与疾病白化病Albinism42酪氨酸酶与Ⅰ型泛素性白化病酪氨酸酶催化结构域点突变可以使酪氨酸酶的活性降低甚至消失，黑色素合成减少或不能合成，导致Ⅰ型泛素性白化病;酪氨酸酶催化结构域以外的点突变导致色素缺失，蛋白质不能正确折叠，不能从内质网输出而滞留在内质网，无法完成其成熟及运输过程。43蛋白转运异常酪氨酸酶P蛋白高尔基体黑色素体P蛋白基因突变黑色素合成障碍引起Ⅱ型泛发性白化病内质网酪氨酸酶与Ⅰ型泛素性白化病44第五节

蛋白质降解异常与疾病蛋白质降解途径溶酶体：降解细胞吞入的胞外蛋白质泛素-蛋白酶体：降解胞内泛素化的蛋白质泛素(ubiquitin,Ub)E1(泛素激活酶)E2(泛素结合酶),E3(泛素连接酶)26S蛋白酶体(proteasome)

45泛素-蛋白酶体途径46泛素-蛋白酶体系统活性被异常抑制或激活均可导致机体紊乱。2004年诺贝尔化学奖阿龙·切哈诺沃(Aaron

Ciechanover)阿夫拉姆·赫什科(Avram

Hershko)欧文·罗斯(Irwin

Rose)47（一）高血脂：载脂蛋白的过度降解载脂蛋白（apolipoprotein,apo)：与脂质结合的运输载体泛素-蛋白酶体系统在维持正常载脂蛋白含量中起到重要的作用，该系统功能障碍，会导致载脂蛋白含量异常。ApoAⅠ,ApoB100,ApoE,etc.48（二）阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)抑制蛋白酶体活性

中枢神经系统退行性病变的疾病。表现为近期记忆力降低，继而表现持续性智能衰退、失语、判断推理能力丧失，以及运动障碍等。AD最显著的神经病理组织学特征是老年斑和神经原纤维缠结。现已发现，β-淀粉样蛋白在老年斑的形成过程中起十分重要的作用。49第六节病原微生物基因引起的疾病感染引起机械或生物学损伤；争夺营养造成营养缺乏；毒素引起细胞代谢功能异常；基因整合到宿主基因组，造成基因结构改变和表达异常。5051第七节基因结构和表达与疾病的研究策略1.通过基因结构分析确定基因变异3.通过功能学研究确定致病基因转基因技术、基因敲除、反义技术、基因诱导超表达2.基因表达水平分析差异显示、抑制消减杂交、基因表达系列分析52测序：双脱氧自动化序列分析SSCP：单链构象多态性分析RFLP：限制性酶切长度多态性DNA芯片AS-PCR:等位特异性PCRASO杂交：寡核苷酸斑点杂交MS-PCR：甲基化PCRDGGEetc.一、基因结构分析53

基本原理:在一定条件下，异源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中错配碱基可被核糖核酸酶RNase识别并切割，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小，即可确定错配的位置。1.核糖核酸酶切分析（RNasecleavage）54GCATACGTAT野生型5´3´3´5´突变型GCTTACGAAT3´3´5´5´异源杂合双链酶切GCAUACGTAT3´5´3´5´3´5´3´5´GCAUACGAAT？体外合成RNA探针GCAUA5´3´野生型探针155GCATACGTAT野生型5´3´3´5´突变型GCTTACGAAT3´3´5´5´异源杂合双链酶切TATGCATACG3´5´3´5´3´5´3´5´TATGCATTCG体外合成RNA探针TATGC5´3´野生型探针256未发生酶切发生酶切电泳分离57缺点：当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，核糖核酸酶切割效率低甚至不切割；分析DNA的一条链，突变检出率为30%；同时分析DNA的两条链，突变检出率为70%；需要制备特异性的RNA探针58

2.杂合双链分析法

（heteroduplexanalysis,HA）

直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型DNA双链。由于突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成单链环形突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应同源双链DNA不同的迁移率。59杂合双链分析（heteroduplexes

analysis）非变性胶电泳5′5′GCTACGAT缺失突变型GCATACGTAT野生型5′3′3′5′3′3′野生型DNA探针与野生型DNA杂交GCATACGTATTATGCATACG5′5′3′3′5′5′3′3′形成异源杂合双链野生型DNA探针与缺失型DNA杂交TATGCATCGCGATGCATA5′3′3′5′5′3′3′5′60缺点：只适合200～300bp的片段;不能确定突变的具体位置;检出率一般只有80%左右。61

3.化学切割错配法

（Chemicalcleavageofmismatch,CCM）基本原理：将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或RNA片段混合后，变性处理，进行杂交。在异源杂合的双链核酸分子中：错配的C能被羟胺和哌啶切割，错配的T能被四氧化锇切割，变性凝胶电泳可确定是否存在突变。

62特点：突变检出率高；如使用荧光检测系统，灵敏度较高；可检测长度达2Kb的核酸片段；步骤多、费时、有毒；634.酶促切割错配(enzymemismatchcleavage)酶：T4内切核酸酶VII识别的序列：DNA:DNA异源杂合分子优点：最长检测片段可达1.5kb，省去体外合成RNA探针的步骤缺点：会产生非特异性切割，对错配位点的识别也不是100%64二、基因表达水平分析Northern杂交定量RT-PCR基因表达芯片差异显示技术抑制性消减杂交基因表达系列分析651.差异显示技术(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionchainreaction,DDRT-PCR)

在不同的生长时期、在个体发育与分化不同阶段、在生物体对疾病的反应以及不同环境下调控基因的表达是不同的，这就是基因的差异表达（differentialexpression）。原理：利用两组特殊引物对差别表达的基因进行扩增。663′端引物：利用mRNA的polyA尾巴设计。根据mRNA结构分析知道，polyA尾巴之前的两个碱基只有12种可能的排列组合：

5′-AGAAAAA…AA-3′5′-CGAAAAA…AA-3′5′-GGAAAAA…AA-3′5′-TGAAAAA…AA-3′5′-ATAAAAA…AA-3′5′-CTAAAAA…AA-3′

5′-GTAAAAA…AA-3′5′-TTAAAAA…AA-3′5′-ACAAAAA…AA-3′5′-CCAAAAA…AA-3′5′-GCAAAAA…AA-3′5′-TCAAAAA…AA-3′67

这些引物由11～12个T及两个其它的碱基组成，用通式5′-T11MN或5′-T12MN表示，M为A、G、C的任一种，N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定引物。68

为10个碱基随机排列组成的随机引物。为了能对更多的基因进行分析，应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5′随机引物。5′端引物695′

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3′Poly(A)RNA5′T12MN3′锚定引物逆转录5′

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3′3′MNTTTTTTTTTTTT5′变性5′

M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3′3′MNTTTTTTTTTTTT5′退火5‘T12MN3’锚定引物寡核苷酸随机引物3′MNTTTTTTTTTTTT5′延长dNTP、Taq聚合酶3′MNTTTTTTTTTTTT5′5′M’N’AAAAAAAAAAA3′变性、退火、延伸电泳显示T12MN(M为A、G、C，N为A、T、G、C)

启动cDNA第一链合成不同长度的PCR产物回收差异条带，再扩增，克隆测序，同源比对随机结合到cDNA链上70差异显示技术特点简单易行快速实验样品需要量低多能性对低丰度mRNA的富集效率低、假阳性712.抑制性差减杂交(SSH)---DiatchenkoL,etal.PNAS1996;93:6025-6030Suppressionsubtractivehybridization:amethodforgeneratingdifferentiallyregulatedortissue-specificcDNAprobesandlibraries72原理

a.SSH是差减杂交与PCR结合的快速分离差异基因的方法。运用杂交动力学原理，丰度高的单链DNA退火时产生同源杂交速度快于丰度低的单链DNA，使不同丰度的单链DNA得到均衡；

b.抑制PCR利用链内退火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构,无法作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增，从而使目的基因得到富集、分离。73方法提取实验组和对照组mRNA合成双链cDNA，经识别4碱基的限制性内切酶RsaⅠ切割实验组cDNA平均分为2份，分别连接2个接头进行2轮差减杂交和PCR获得富集的目的基因74检测组(Tester)—

含目的基因cDNA，加接头驱逐组(Driver)—

不含目的基因cDNA，不加接头*接头含PCR引物正向SSH:易感者(Tester)+不易感者(Driver)易感者特异表达或高表达基因反向SSH:不易感者(Tester)+易感者(Driver)不易感者特异表达或高表达基因

75抑制性差减杂交(SSH)

流程图76优点采用两次差减杂交和PCR，保证了高特异性(假阳性率可降至6％);在杂交过程中可使不同丰度基因均衡化，获得低丰度差异表达基因;操作相对简便，是目前分离新基因的主要方法。缺点起始材料需要

g级量mRNA;SSH差减克隆片段较小，获取cDNA全长序列有一定难度。77ElkelesA,etal.MolCellBiol

，1999;19:2594-2600Thec-fosproto-oncogeneisatargetfortransactivationbythep53tumorsuppressor采用SSH法证实,在p53介导的细胞凋亡过程中，c-fos是p53转录刺激的靶基因,从而提供了这两种重要调控蛋白相互作用的直接依据。抑制性差减杂交(SSH)78KosticCandShawPH.Oncogene，2000;19:3978-3987Isolationandcharacterizationofsixteennovelp53responsegenes

通过SSH比较了p53缺失和含p53的结肠癌细胞株间基因差异表达，发现16个p53依赖的下游靶基因。抑制性差减杂交(SSH)793.基因表达系列分析

(SerialAnalysisofGeneExpression,SAGE)

是一种用于定量、高通量基因表达分析的实验方法(Velculescuetal.,1995)。SAGE原理:分离每个转录本特定位置的较短单一的序列标签（约9-11个碱基对），这些短的序列被连接、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应基因的表达丰度。80Serialanalysisofgeneexpression(SAGE)技术流程反转录酶切连接测序单条测序＝＝对30－40条EST测序分析由于采样量大大提高，可对低表达基因进行分析：基因表达量分析、寻找新基因等等实验步骤较长要求较高81三、基因功能的研究转基因技术基因打靶反义寡核苷酸技术反义RNA技术核酶技术RNA干扰技术基因诱导超表达技术反义技术821.转基因技术

指在生物基因组中带有插入或整合的外源基因，生物个体能将它传给后代，并表达出该基因的生物活性物质，从而使受体生物获得新的性状。83

采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。

转基因——

被导入的目的基因转基因动物(transgenicanimal)——

目的基因的受体动物84基本方法显微注射法胚胎干细胞法(embryonicstemcells,ES细胞)逆转录病毒感染法精子载体法转基因动物中外源基因的检测染色体及基因水平：斑点杂交、Southern杂交、PCR转录水平：Northern杂交蛋白质水平：Western印迹85转基因动物操作技术流程

获取外源目的基因含有外源目的基因的重组载体导入生殖细胞或胚胎干细胞选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物转基因胚胎的发育及鉴定筛选所得的转基因动物简明操作步骤86

转基因动物实例一超级奶牛－普通奶牛的三倍大（英国）87转基因动物实例二东北农业大学－国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪绿色荧光蛋白－猪胎儿成纤维细胞－克隆

88转基因动物实例三转绿色荧光蛋白的兔89转基因动物实例四正在进行转基因山羊的实验

乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊上海交通大学医学遗传研究所902.基因打靶(genetargeting)通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究该基因的功能。基因敲除(geneknockout)：定向敲除基因敲入(geneknockin)：定向替代91MarrioCapecchi于八十年代末在Utah大学发展起来。实验动物通常是小鼠，被敲除了功能基因的小鼠就称为敲除小鼠(knockoutmice)。基因敲除技术是研究基因功能的一项非常有用的技术(遗传病研究、研究特定基因的细胞生物学活性以及研究发育调控的基因作用）。基因敲除是一套组合技术，包括基因重组、细胞分离培养、转基因等。92基因打靶的必备条件胚胎干细胞(ES细胞)能在体外培养，保留发育的全能性打靶载体Neo（新霉素）阳性筛选标志HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)93基因敲除的基本程序打靶载体的构建打靶载体导入ES细胞：重组置换基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫中嵌合体的杂交育种9495美国犹他大学MarioR.Capecchi美国北卡罗来纳州大学Oliver

Smithies英国卡迪夫大学MartinJ.Evans2007年诺贝尔生理学或医学奖:基因打靶963.反义技术97

核酶技术确定基因在疾病中的作用（1）RNA分子，催化核糖体RNA中内含子的自我拼接；除了催化RNA的剪切，还可催化DNA的剪切、RNA的聚合、RNA链的复制等。（2）优点:其底物的碱基配对特异性。核酶与底物结合常形成“发夹”结构或“锤头”结构。（3）设计核酶特异性地结合于靶点，以其本身酶活性进行剪切。98核酶的作用机制

99

与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。

100

反义RNA技术

antisenseRNA

自身没有编码功能，但能与目标RNA特别是mRNA的特定区域互补结合的一类RNA;自然存在，或人工生物合成。101反义寡核苷酸技术

(antisenseoligonucleotide,ASON)

人工合成的能与目的DNA或RNA互补的寡核苷酸（15-20nt）。肽核酸(peptidenucleicacid,PNA)

核酸分子中的磷酸二酯键骨架被酰胺键骨架取代，具有更强的稳定性。1024.RNA干扰（RNAinterference，RNAi）内源性或外源性双链RNA介导的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型的缺失现象。103共抑制现象的发现

ＲＮＡｉ研究的早期线索早在20年前,来自于美国和荷兰的两个转基因植物实验组RichJorgensen和同事,在对矮牵牛(petunias)进行的研究中有个奇怪的发现:将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵的紫颜色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多数花成了花斑的甚至白的。Jorgensen将这种现象命名为共抑制(cosuppression),因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。开始这被认为是矮牵牛特有的怪现象,后来发现在其他许多植物中,甚至在真菌中也有类似的现象。

104105RNAi现象的发现线虫（C.elegans)1995年康乃尔大学的研究人员Guo和Kemphues+Par-1GeneDisruptionExpressionDownDoubleStrandRNA线虫，果蝇微生物，植物

106

1998年被解开———华盛顿卡耐基研究院的AndrewFire和马萨诸塞大学癌症中心的CraigMello首次使用双链dsRNA高效地特异性阻断同源基因的表达。实验表明在线虫中注入双链ＲＮＡ不单可以阻断整个线虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉默。他们将这种现象称为ＲＮＡ干扰。107dsRNADicercleavageofdsRNAsiRNARNAi抑制基因表达的机理siRNAassociatedWithRISCcomplexCellMembrane5’POH3’TargetmRNA1085.基因诱导超表达技术

将目的基因全长序列与高活性启动子或组织特异性启动子融合，经过转化后，在诱导剂的作用下或在特定的组织细胞中，目的基因超表达，相应的基因表达产物大量积累。比较加入诱导剂前后的表型变化，从而确定目的基因在疾病发生中的作用。109Thankyou110附1、疾病相关基因的功能克隆和定位克隆1．疾病相关基因2．功能克隆3．定位克隆1111、疾病相关基因与疾病单基因病(一个基因位点上的缺陷)多基因病(涉及两个以上的基因位点)染色体病(染色体结构与数目的改变)获得性基因病(遗传易感性或病原微生物)112２、功能克隆(Functionalcloning)

以获得的蛋白质表达及功能信息为线索，分离鉴定出相应的基因，叫未知基因的功能克隆。113

功能克隆（

functionalcloning）---根据特异蛋白质分离目的基因的策略表型克隆（phenotypecloning）---根据特异mRNA分离目的基因的策略114

氨基酸序列核苷酸序列PCR特异蛋白质

目的基因

抗体基因文库筛选评价优点--

在单基因性状的基因分离方面仍为常用策略缺点--

特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难*

--难以分离微量表达基因

--无法研究无蛋白质产物的基因

--难以进行多基因控制性状的基因分离115通过蛋白质的抗原抗体反应分离鉴定未知基因

基因转录后在核糖体上翻译合成蛋白质，形成核糖体-mRNA-蛋白质产物部分氨基酸序列的复合体，运用抗体与蛋白质产物的免疫共沉淀反应，可以分离此复合体，进而分离到mRNA，最终克隆到未知基因。116西红柿女孩

一女孩患苯丙酮尿症，不食“人间烟火”，仅能吃西红柿。智力发育不全、严重的呕吐，皮肤、毛发颜色变浅，虹膜颜色减退、尿、汗有特殊腐臭。目前以低苯丙氨酸饮食治疗。117３、定位克隆又称为“逆向遗传学”，始于20世纪80年代后期利用遗传连锁或细胞学定位技术将致病基因定位于染色体的特定区带。定位：通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的位置。克隆：从定位的染色体区段内分离克隆所要的基因，并进一步研究其功能。疾病遗传标记，染色体定位基因序列mRNAcDNA蛋白质产物生物学功能

疾病

基因功能118定位克隆：通过遗传标记，先获得某一表型基因在染色体上的定位，再在候选区域内选择已知基因，进行致病突变的筛选，