基因组学与系统毒理学

毒理基因组学与系统毒理学(ToxicogenomicsandSystemsToxicology)王安（Ph.D，副教授）Mailaddress：csuwang@；walwry@163.comPhonenumber十章10*1【主要内容】

概述

毒理基因组学研究的技术平台

毒理基因组学研究内容及应用

从毒理基因组学到系统毒理学毒理基因组学与系统毒理学*2

掌握毒理基因组学含义，熟悉人类基因组计划的主要研究内容；

熟悉毒理基因组学研究的技术平台；

了解毒理基因组学研究内容及应用；【目的要求】毒理基因组学与系统毒理学*3第一节概述毒理基因组学与系统毒理学*4不同人种之间头发、肤色、眼睛、鼻子等不同基因差异CaucasianNegroAfricanAmericanMongoloid毒理基因组学与系统毒理学*5基因（Gene）？是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。

携带有遗传信息的DNA序列，是具有遗传效应的DNA分子片段；

是控制性状的基本遗传单位，通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，控制生物个体的性状表现。AgeneisasetofsegmentsofnucleicacidthatcontainstheinformationnecessarytoproduceafunctionalRNAproductinacontrolledmanner.Theycontainregulatoryregionsdictatingunderwhatconditionsthisproductismade,transcribedregionsdictatingthesequenceoftheRNAproduct,and/orotherfunctionalsequenceregions.Thephysicaldevelopmentandphenotypeoforganismscanbethoughtofasaproductofgenesinteractingwitheachotherandwiththeenvironment，andgenescanbeconsideredasunitsofinheritance.毒理基因组学与系统毒理学*6一般的定义是单倍体细胞中的全套染色体为一个基因组，或是单倍体细胞中的全部基因为一个基因组。基因组（Genome）基因组测序的结果发现基因编码序列只占整个基因组序列的很小一部分。因此，基因组应该是单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。更确切的说，核基因组是单倍体细胞核内的全部DNA分子；线粒体基因组则是一个线粒体所包含的全部DNA分子；叶绿体基因组则是一个叶绿体所包含的全部DNA分子。毒理基因组学与系统毒理学*7人类基因组研究大事记1860至1870年，孟德尔根据豌豆杂交实验提出遗传因子概念，总结出孟德尔遗传定律。1944年，艾弗里、麦克劳德和麦卡蒂3位美国科学家分离出细菌的DNA，发现DNA是携带生命遗传物质的分子

1953年,美国人沃森和英国人克里克通过实验提出了DNA分子的双螺旋模型1969年,美国科学家夏皮罗分离出第一个基因("乳糖操纵子")。1990年10月，人类基因组计划在美国正式启动。1984年卡瑞·缪里斯博士等发明大规模复制DNA的技术-PCR技术。1977年，美国和英国科学家开发出DNA测序的方法。1909年，丹麦植物学家和遗传学家约翰逊首次提出“基因”的名词，用以表达孟德尔的遗传因子概念。摩尔根1926年发表了《基因论》，建立了基因学说，奠定细胞遗传学的基础。毒理基因组学与系统毒理学*8人类基因组计划（HGP）人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。这一计划旨在为30多亿个碱基对构成的人类基因组精确测序，发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息。美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划（各国所承担工作比例约为美国54%，英国33%，日本7%，法国2.8%，德国2.2%，中国1%）。按照这个计划的设想，在2005年，要把人体内约10万个基因的密码全部解开，同时绘制出人类基因的谱图。换句话说，就是要揭开组成人体4万个基因的30亿个碱基对的秘密。毒理基因组学与系统毒理学*9人类基因组计划三大科学计划曼哈顿原子弹计划阿波罗计划HGP目的解码生命、了解生命的起源、了解生命体生长发育的规律、认识种属之间和个体之间存在差异的起因、认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象、为疾病的诊治提供科学依据。毒理基因组学与系统毒理学*10HGP的主要任务是人类的DNA测序，包括四张谱图。

1.建立遗传图：利用染色体上基因交换频率，推断基因之间的遗传距离，根据点测交实验确定各个基因的相互位置和排列顺序，绘制基因连锁图。

2.建立物理图：用限制酶将染色体切割成若干片段，利用互补原理通过分子杂交法，以一小段DNA序列作为标记，分析标记间的距离并确定各个片段在染色体上的实际排列顺序。

3.序列图谱（DNA序列测定）：DNA序列分析技术是一个包括制备DNA片段化及碱基分析、DNA信息翻译的多阶段的过程。通过测序得到基因组的序列图谱（核心的工作）。

4.基因图谱：是在识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础上绘制的结合有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。主要内容毒理基因组学与系统毒理学*111997年美国国立环境卫生科学研究所（NIEHS）环境基因组计划（EnvironmentalGenomeProject，EGP）主要目标：推进有重要功能意义的环境应答基因的多态性研究，确定其引起环境暴露致病危险性差异的遗传因素，以开展和推动环境-基因相互作用对疾病发生影响的人群流行病学研究为最终目的毒理基因组学与系统毒理学*12毒理基因组学（toxicogenomics）研究生物体的整个基因组如何对环境有害因素发生反应的一门新兴学科。

化学因素（化学物，混合化学物等）

物理因素（电离与非电离辐射，噪声，异常气温等）

生物因素（细菌，病毒等）研究基因组与化学毒物间的交互作用及其方式的学科称为毒物基因组学。毒理基因组学与系统毒理学*13毒理基因组学研究计划（ToxicogenomicsResearchProgram，TRP）研究内容基因组水平的效应基因的RNA表达（转录组学）蛋白产物表达（蛋白组学）代谢谱的改变（代谢组学）遗传多态性生物信息学利用人类基因组的资料，帮助筛选和鉴别潜在的环境毒物，并在基因组水平上阐明毒作用发生的机制。毒理基因组学与系统毒理学*14TRP研究目标确定某种有害因素的反应基因（信号基因）用于毒理学和相关疾病的研究建立全基因组与蛋白质组毒性反应知识库，并在此基础上开辟以芯片技术和生物信息技术为特征的数字毒理学（Digitizedtoxicology)。从传统的遗传毒性检测方法基因群检测方法显著提高遗传损伤检测水平和降低检测的阈值毒理基因组学与系统毒理学*152000年，美国环境卫生科学研究所（NIEHS）国家毒理基因组学中心（NationalCenterforToxicogenomics，NCT）的主要任务：

促进基因和蛋白表达技术在毒理学中的应用

促进人类环境暴露和疾病易感性关系的研究

确定暴露和毒效应的生物标志

推进暴露与生物学反应关系的计算和处理方法

建立毒理基因组学公用数据库。毒理基因组学与系统毒理学*162000年6月26日克林顿宣布人类基因组草图绘制完成2003年4月14日，中、美、日、德、法、英等6国科学家宣布人类基因组序列图绘制成功，已完成的序列图覆盖人类基因组所含基因区域的99％，精确率达到99.99%。基因组时代后基因组时代毒理基因组学与系统毒理学*17后基因组时代（post-genomeera）人类后基因组计划--对基因组生物学功能的研究和应用序列（结构）基因组学功能基因组学功能基因组学生物信息学比较基因组学蛋白质组学结构基因组学整体生物学DNA芯片药物基因组学基因敲除毒理基因组学与系统毒理学*18毒理基因组学面临的基本挑战高通量筛选系统如微阵列（芯片技术）计算机技术

如何获取大规模生物学数据包括基因组、转录组、蛋白质组和代谢组

的表达数据对获取的大量信息进行及时而合理的处理

如DNA微阵列技术的基因

表达数据；还有经典的

毒理学实验数据毒理基因组学与系统毒理学*19毒理基因组学研究的技术平台第二节毒理基因组学与系统毒理学*20一、基因组学与转录组学技术平台（一）差异显示反转录PCR技术差异显示反转录PCR（DDRT-PCR）技术是以分子生物学应用最广泛的两种技术—PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础。基本原理：是以一对细胞（或组织）的总RNA反转录而成的cDNA为模板，利用PCR的高效扩增，通过5′端和3′端引物的合理设计和组合，将细胞（或组织）中表达的约15000种基因片段直接显示在DNA测序胶上，从而找出其表达有差异的cDNA片断。优点：DDRT-PCR具有周期短，功能多，灵敏度高，所需RNA量少和重复性高等。缺点：DDRT-PCR技术假阳性率高、凝胶中单条cDNA带成分不均一、一些低拷贝数mRNA不能有效呈现等。毒理基因组学与系统毒理学*21（二）基因表达序列分析(serialanalysisofgeneexpression，SAGE)SAGE的理论依据是：来自cDNA3′端特定位置的一段9-11bp长的序列能够区分基因组中95％的基因。这一段基因特异的序列被称为标签(SAGEtag)。通过对cDNA制备SAGE标签并将这些标签串联起来，然后对其进行测定。SAGE应用的前提条件：GenBank中必须有足够的某一物种的DNA序列信息，尤其是表达序列标签(expressedsequencetag，EST)的序列资料。

各SAGE所代表的基因在特定组织中是否表达；

根据各SAGE标签所出现的频率作为其所代表的基因表达丰度的指标。毒理基因组学与系统毒理学*22（三）微阵列分析DNA微阵列(microarrayassay)或DNA芯片(DNAchip)技术，可以在同时定量的分析大量的基因表达，具有快速、精确、低成本之分析检验能力。基因芯片通过微加工技术，将数千或数万个特定序列的DNA片段（基因探针）有规律地排列固定于2c㎡的硅片、玻片等支持物上，构成一个二维的DNA探针阵列，因与电子计算机上的电子芯片十分相似所以被称为基因芯片。使用的基本硬件，是一块带有DNA微阵列（micorarray）的特殊玻璃片或硅芯片片，在数平方厘米之面积上布放数千或数万个核寡聚核苷酸片段或cDNA探针(cDNA、EST或基因特异的寡核苷酸)，按一定顺序以矩阵方式排列在载玻片大小的塑料或玻璃板上，其敏感性可达1～5个拷贝mRNA/细胞。与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。毒理基因组学与系统毒理学*23基因表达的测定：先将受试动物染毒，其靶器官或细胞与毒物接触后，发生反应或被活化的基因会产生mRNA。然后将这些mRNA用核素或荧光色素标记后，加入基因芯片。在一个单个的阵列中加入两种标记样品进行杂交。杂交完成后，可用图像解析显微镜或激光扫描显微镜进行探测和分析。根据发生的结合反应的情况，便可以判断是哪些基因发生了改变。通常采用发红色荧光的Cy3和发绿色荧光的Cy5荧光色素，分别标记实验和对照样品中的RNAs。由于荧光的强度和RNAs的含量间有一定的相关关系，可通过两种荧光的相对强度变化来确定实验组样品中DNA表达的差异。如果再与实时PCR相结合，就可得到特定基因的定量表达信息，发现新的致病基因或疾病相关基因等多个研究领域。毒理基因组学与系统毒理学*24优点：

灵敏度高mRNA丰度低至10万分之一仍能被检测出；

可同时采用几种不同颜色的荧光染料标记探针，在同一张阵列膜进行一次杂交实验就可分析不同样品间基因表达的差异。缺点：

成本较高，需要特殊的信号检测分析系统；

玻片上的微阵列不能重复使用。毒理基因组学与系统毒理学*25（四）RNA干扰技术（RNAinterference，RNAi）将外源性双链RNA导入细胞后，可产生21-23nt（nucleotide，核苷酸）长度的小分子干扰RNA（siRNA），引起与其序列同源的特异基因mRNA降解的现象，为转录后的基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing，PTGS）在哺乳动物细胞进行RNAi实验包括五个步骤：选取目的基因设计相应的siRNA制备siRNAsiRNA转染哺乳动物细胞RNAi效果分析毒理基因组学与系统毒理学*26

靶siRNA序列选择是RNAi实验成败的关键；

siRNA的制备方法：化学合成法，体外转录法，合成法和“鸡尾酒”法；

siRNA转染是将siRNA，siRNA表达载体或siRNA表达框架（siRNAexpressioncassettes,SECs）导入哺乳动物细胞；

RNAi的效果可从mRNA和蛋白质水平进行评价；

mRNA水平可通过Northernblot和实时定量PCR（real-timeRT-PCR）的方法；蛋白质水平可通过Westernblot、荧光免疫法、流式细胞技术和表型分析等方法检测。毒理基因组学与系统毒理学*27

染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中发生频率大于1%。（五）单核苷酸多态性检测（singlenucleotidepolymorphisms,SNPs）在基因组中搜索SNPs的最普遍的方法是将已定位的序列标签位点（sequencetaggedsites,STS）和表达序列标签（expressedsequencetags,EST）进行测序DNA芯片技术的应用可大规模发现和识别SNPs有单碱基的转换、颠换、插入、缺失等形式在基因组中分布不均匀，随机分布在基因组的单碱基变异，在基因编码区估计有2×105个SNPs,称为cSNPs（coding-regionsSNPs），与蛋白质功能有关。毒理基因组学与系统毒理学*28限制性酶切片段长度多态性技术（RFLP）SNPs的检测方法等位基因特异寡聚核苷酸杂交技术（ASO）单链构象多态性技术（SSCP）基因芯片技术毒理基因组学与系统毒理学*29Takeabreak毒理基因组学与系统毒理学*30二、蛋白组学技术平台目前最常用技术路线是利用双向凝胶电泳分离蛋白、综合质谱和生物信息学分析技术进行鉴定双向凝胶电泳和质谱技术是目前蛋白质组学研究的核心技术毒理基因组学与系统毒理学*31（一）双向凝胶电泳（2-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE）样品制备原理：细胞抽提物在电泳过程中，依据蛋白质所带电荷及分子大小而被分离。实验成败的关键要尽可能使样品转变为适合进行电聚焦的状态，同时保持原有的电荷和等电点为尽可能多地获得样品中的蛋白质，可采用预分级处理方法根据蛋白质溶解性的不同进行分步顺序提取，增强特定蛋白点的浓度，提高低丰度蛋白质的上样量；预先对细胞亚结构进行分离，利用传统梯度离心法分离各种细胞器，再提取蛋白进行二维电泳，建立相应的亚细胞蛋白质组数据库毒理基因组学与系统毒理学*32电泳

梯度凝胶电泳：使用窄pH及极窄pH范围梯度凝胶电泳，提高2-DE分辨率。适用于低丰度蛋白的检测

胶上差示电泳（differentialin-gelelectrophoresis,DIGE）将不同样品蛋白质标上不同的荧光染料，在同一块胶上进行电泳分离，用荧光扫描仪进行识别。该方法重复性好，灵敏度高，质谱兼容等优点。缺点不能很好显示低丰度蛋白、疏水性膜蛋白、极酸或极碱性、极大和极小分子量蛋白；不同样本间难以进行定量比较；费时、费力，不容易自动化；重复性差。毒理基因组学与系统毒理学*33（二）生物质谱技术（biologicalmassspectrometryBMS）基本原理：使样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定相对分子质量。

基质辅助激光解吸离子质谱（metrixassistedlaserdesorptionionizationmassspectrometry，MALDI）

电喷雾离子化质谱（electrosprayionizationmassspectrometry，ESI）

表面增强激光解吸电离-飞行时间质谱（surface-enhancedlaserdesorptionionization，SELDI）结合芯片和质谱技术，将蛋白质样品制备、生化反应和检测分析等过程集成在芯片上进行，在数分钟内同时分析几百种蛋白质，样品体积可低至0.5μl，利于微量样本研究。毒理基因组学与系统毒理学*34

多向蛋白鉴定技术（multi-dimensionalproteinidentificationtechnology，MudPIT)将蛋白质酶解后得到多肽混合物，进样到强阳离子交换色谱柱，直接洗脱后进样到反相液相色谱柱上，然后进行梯度洗脱，用MS/MS对分离的馏分进行鉴定。一个分析周期可检测100多种蛋白质，适用于大规模蛋白质的分离鉴定。

同位素亲和标签（isotope-codedaffinitytag，ICAT）利用化学性质相同而质量不同的两种同位素分子，对蛋白样品的半胱氨酸进行标记，然后对混合的样品进行质谱分析，通过比较质谱峰的强弱可以对蛋白质进行定量比较。具有广泛的兼容性和高度专一性，而且适用于低丰度蛋白分析，是差异蛋白质组定量分析研究的有力工具。毒理基因组学与系统毒理学*35

分子扫描技术（molecularscannertechnology）将双向凝胶转到涂有酶解液的膜上，在转膜的同时进行酶切，再利用质谱扫描鉴定

抗体与蛋白质阵列技术（antibodyandproteinarraytechnologies）将双向凝胶转到涂有酶解液的膜上，在转膜的同时进行酶切，再利用质谱扫描鉴定毒理基因组学与系统毒理学*36三、代谢组学技术平台代谢组学（metabonomics/metabolomics）是研究关于生物体被扰动后其代谢产物（内源性代谢物质）种类、数量及其变化规律的科学。代谢组学研究生物整体、器官或组织的内源性代谢物质的代谢途径及其所受内在和外在因素的影响及随时间变化的规律。

作为全局系统生物学的基础和重要组成部分，代谢组学是以物理学基本原理为基础的分析化学、以数学计算与建模为基础的化学计量学和以生物化学为基础的生命科学等学科交叉的学科。

作为基因组、转录组和蛋白组的“终端”，能够更直接、更准确地反映生物体的病理生理状态。毒理基因组学与系统毒理学*37技术路线及方法检测和分析内源性代谢物信息技术

核磁共振（NMR）

色谱及联用技术（GC-MS\LC-MS）

红外光谱(IRspectrum）

毛细管电泳（CE）采样（血样尿样或其他）代谢物的提取上机检测（GC-MS\LC-MS\NMR）数据预处理（信息峰提取、识别）多元变量统计分析（PCA、PLS-DA、OPLS-DA）深度数据挖掘（代谢通路分析、关联分析）毒理基因组学与系统毒理学*38（一）磁共振（nuclearmagneticresonance，NMR）可在一次单独检测中获得生物体液中成百上千的代谢物组分信息，而无需预先确定被检测物质的性质。所需样品量较少，不需要复杂的样品处理或衍生措施，且样品还可回收用于其他分析。

氢谱（HNMR)：对含氢化学物均有响应，能完成对样品中大多数代谢物的检测，具有较高的灵敏度和较好的重复性。

碳谱（CNMR)：可以给出分子量在500以下的有机化学物丰富的碳骨架信息，适合检测低分子量物质，并可为氢谱提供物质结构的补充信息，但存在灵敏度低，采样时间长，所需样品量大的缺点毒理基因组学与系统毒理学*