中国海洋大学分子生物学 复习资料

DasallesistDeutschland~2010DasallesistDeutschland~2010分子牛物学第第#页共19页至其结合位点。第6章基因表达调控主要内容：第一节基因表达调控概论第二节原核基因表达调控第三节真核基因表达调控基因组(genome)：一个细胞或病毒所携带的全部遗传信息或整套基因。正调控：新加入的调节蛋白开启结构基因的表达。负调控：新加入的调节蛋白关闭结构基因的表达。负调控系统：调节蛋白一阻遏蛋白基因表达㈩一调节蛋白一基因表达关闭㈠正控制系统：调节蛋白一诱导蛋白基因关闭㈠丁调节蛋白一基因表达开启㈩诱导型操纵子与阻遏型操纵子诱导物与诱导：在基因表达调节中能开启或促进基因转录表达的小分子化合物叫做诱导物。只有在小分子诱导物存在时诱导型操纵子(inducibleoperon)才能发挥作用。阻遏物与阻遏：产生阻遏作用的小分子物质为阻遏物，也称为辅阻遏物。阻遏型操纵子(repressibleoperon)只有在小分子阻遏物不存在时才能发挥作用，加入小分子阻遏物则关闭基因的转录。四种调控类型(负调控针对阻遏蛋白，正调控针对激活蛋白，阻遏后基因不转录，诱导后基因转录)可诱导负调控一一阻遏蛋白有活性，基因不转录；阻遏蛋白与诱导物结合失活，基因转录。可阻遏负调控一一阻遏蛋白无活性，基因转录；阻遏蛋白与辅阻遏物结合，基因不转录。可诱导正调控一一激活蛋白无活性，基因不转录；激活蛋白与诱导物结合激活，基因转录。可阻遏正调控一一激活蛋白有活性，基因转录；激活蛋白与辅阻遏物结合，基因不转录。管家基因(house-keepinggene)：某些基因在一个生物体几乎所有细胞中持续表达，其产物在细胞里总是存在的，通常被称为管家基因。顺式作用元件(cis-actiongelement)：是指可影响自身基因表达活性的特异DNA序列。通常是非编码序列。包括启动子、增强子及沉默子等。反式作用因子(trans-actiongelement)：绝大多数真核转录调节因子由某一基因表达后，通过与特异的顺式作用元件相互作用，影响另一基因的转录，称为反式作用因子。原核生物的转录调节特点：操纵子模型具有普遍性阻遏蛋白与阻遏机制具有普遍性b因子决定RNA聚合酶识别特异性乳糖操纵子及应用基因Z：卩-半乳糖苷酶基因，分解乳糖为半乳糖和葡萄糖；基因Y：乳糖透性酶基因，增加细胞壁透性，有助于乳糖进入基因A：半乳糖苷乙酰转移酶基因，催化乙酰基从乙酰辅酶A操纵基因0：转录起点位置，调节基因产生的阻遏物附着处；m=iw和代IM勒剛赳■时尤悟性醐別由釣ffT-4①NliH恬性皿滞曲肛過諛烬■:-如■和即対旳调控区搽姒洋列启动序列结合位点调节基因启动子P：RNA聚合酶聚集的地方；CAP位点：激活蛋白结合位点，激活蛋白通过cAMP对葡萄糖作出反应；调节基因I：编码阻遏蛋白或激活蛋白。Lac负调控模型：乳糖缺乏时，阻遏物封闭操纵序列，RNA聚合酶不能达到转录起点，转录停止；当培养基中有诱导物一一乳糖时，乳糖进入细胞中，与阻遏物结合并使其失活，阻遏物脱离操纵子；RNA聚合酶达到转录起点，转录过程开始，并翻译生成与乳糖代谢有关的3种酶。乳糖操纵子的正调控：Lac操纵子既受到其阻遏蛋白的负调控，也受CAP的正调控；CAP是一类正调控因子，结合于很多启动子，是控制营养代谢有关的操纵子的激活蛋白；CAP活化有赖于第二信使分子环磷腺苷(cAMP);CAP蛋白与cAMP形成复合物后才能结合于CAP结合位点激活Lac操纵子。葡萄糖的降解与cAMP含量有关。CAP结合位点E.coli的乳糖启动子有两个CAP结合位点，一个在-70至到-50(位点I),另一个在-50至U-40(位点II)；位点I是具有强结合位点特征的反向重复序列；当cAMP-CAP复合物结合于位点I，位点II结合复合物的能力显著提高；CAP结合与Lac转录起始的关系CAP-cAMP复合物与启动子上CAP位点结合，促进了RNA聚合酶对-35和-10序列的识别和结合，并形成开放起始复合物，提高了转录效率。cAMP-CRP复合物与启动子区的结合是lacmRNA合成起始所必需的，因为这个复合物结合于启动子上游，能使DNA双螺旋发生弯曲，有利于形成稳定的开放型启动子-RNA聚合酶结构。阻遏物则是一个抗解链蛋白，阻止形成开放结构，从而抑制RNA聚合酶的功能。色氨酸操纵子Trp操纵子可阻遏负调控系统一一粗调控色氨酸操纵子的衰减子调控一一细调控衰减子真核基因表达7个可控点染色体和染色质水平的活化转录水平上的调控，包括基因的开闭，转录活性水平的高低。RNA加工水平上的调控，对初始转录产物的活化、修饰、选择性剪接等。转录后加工产物，如mRNA从细胞核向细胞质转运过程受到的控制。翻译的控制，选择哪种mRNA给核糖体翻译，包括翻译量的控制。蛋白合成后选择性地被激活或失活，蛋白质水平上的剪切、活性水平的控制。控制mRNA的选择性降解是基因表达调控的另一重要方面。基因丢失：原生动物、环节动物、昆虫和甲壳纲某些动物细胞分化时，将丢失染色体的某些DNA片段而永久性消除基因活性。基因扩增：某些基因拷贝数专一性大量增加的现象，其目的在于使细胞在短期内产生大量基因产物以满足生长发育需要。染色体重排：基因重排是一个基因从远离其启动子的地方移到距离较近的地方而启动转录；基因重排显示出基因的多样性，显示出基因组与mRNA复杂性之间没有线性关系。高敏感性位点(preferentialsensitivity)：一般位于基因上游1kbp范围内，长度限于100~200bp，是转录起始有关蛋白质因子与启动子识别、结合的序列；该位点序列可与其它蛋白质结合，阻止组蛋白的结合，从而不形成通常的核小体结构；高敏感点与基因表达有关，高敏感性的出现意味着基因更接近可转录状态。超敏感位点(hypersensitivesites)：超敏感位点与整个基因簇的活化有关，而高敏感位点仅仅同基因簇中某个基因活化转录相关；高敏感位点紧靠活化基因，主要在启动子范围内；而超敏感位点远离基因，而且5‘和3'端成对出现，在超敏感性位点的界限之内是潜在的可活化基因。核小体置换：转录调控蛋白与组蛋白在启动子区域存在相互排斥、置换现象。核小体置换方式：持久性置换、诱导性置换、混合类型。甲基化不足：甲基化与基因活性调节有关：甲基化程度高，基因转录活性低；而甲基化程度低，基因转录活性高。因此活跃基因状态称做甲基化不足(under-methylation)。CpG岛：基因组中稳定成簇的非甲基化GC小片段。增强子：具有正调控功能的顺式作用元件，能明显增加与其连锁基因转录频率；沉默子：为负调控元件。在真核细胞中数量远少于增强子。沉默子的DNA序列被调控蛋白结合后阻断了转录起始复合物的形成或活化，使基因表达活性关闭。26.DNA蛋白检测和纯化>凝胶滞留法>DNA酶足迹法>亲和层析分离纯化DNA结合蛋白27.miRNA与siRNARNAi的机制：⑴double-strandedRNA(dsRNA)intocertainorganismsandcelltypes.⑵Inthecell,longdsRNAsarecleaved(劈开)intoshort21-25exogenousviEiIranspcsan

dsRNAdsHNAdsRNA?RMAs^rthessnucleotidesmallinterferingRNAs,orsiRNAs,byaribonuclease(核糖核酸酶)knownasDicer(step2)帽子.ThesiRNAssubsequentlyassemblewithproteincomponentsintoanRNA-inducedsilencingcomplex(RISC).AnATP-generatedunwindingofthesiRNAactivatestheRISC(step3).RISCinturnbindstothehomologoustranscriptbybasepairinginteractions(碱基互补配对原则)andcleavesthemRNA(step4).⑸ThissequencespecificdegradationofmRNA(step5)resultsingenesilencing.RNAinterference(RNAi)isaphenomenoninwhichtheintroductionofdouble-strandedRNA(dsRNA)intocertainorganismsandcelltypescausesdegradation(降解)ofthehomologous(类似的)mRNA.siRMAd脚|射RdHF|byEKtafiucleafie_一__L'HccndarysiRNAsb)'DICERdegradedRNAbyeoudeases相同点/联系点siRNAmiRNA长度及特征都约在22nt左右，5'端是磷酸基，3’端是羟基合成的底物miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的Dicer酶依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点Argonaute家族蛋白都需要Argonaute家族蛋白参与RISC组分二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠；产生了ontarget和offtarget的问题作用方式都可以阻遏靶标基因的翻译，也可以导致mRNA降解，即在转录水平后和翻译水平起作用进化关系可能的两种推论：siRNA是miRNA的补充，miRNA在进化过程中替代了siRNA不同点/分歧点siRNAmiRNA机制性质往往是外源引起的，如病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生，属于异常情况是生物体自身的一套正常的调控机制直接来源长链dsRNA发夹状pre-miRNA分子结构siRNA是双链RNA，3‘端有2个非配对碱基，通常为UUmiRNA是单链RNA对靶RNA特异性较高，一个突变容易引起RNAi沉默效应的改变相对较低，一个突变不影响miRNA的效应作用方式RNAi途径miRNA途径生物合成，成熟过程由dsDNA在Dicer酶切割下产生;发生在细胞质中pri-miRNA在核内由一种称为Drosha酶处理后成为60nt的带有茎环结构的pre-miRNAs；这些pre-miRNAs在转运到细胞核外之后再由Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟的miRNAs；发生在细胞核和细胞质中互补性一般要求完全互补不完全互补，存在错配现象RISCs的分子量不同siRISCsmiRISCs/miRNP各自的生物学功能不同i抵抗病毒的防御机制(Pfefferetal.,2004;Dingetal.,2004)；ii沉默那些过分表达的mRNA；iii保护基因组免受转座子的破坏。对有机体的生长发育有重要作用(Rhoadesetal.,2002)重要特性高度特异性咼度的保守性、时序性和组织特异性作用机制单链的siRNA结合到RISC复合物中，引导复合物与mRNA完全互补，通过其自身的解旋酶活性，解开siRNAs,通过反义siRNA链识别目的mRNA片段，通过内切酶活性切割目的片段，接着再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。同时，siRNA也可以阻遏3’UTR具有短片断互补的mRNA的翻译(offtarget)。成熟的miRNAs则是通过与miRNP核蛋白体复合物结合，识别靶mRNA，并与之发生部分互补，从而阻遏靶mRNA的翻译。在动物中，成熟的单链miRNAs与蛋白质复合物miRNP结合，引导这种复合物通过部分互补结合到mRNA的3’UTR(非编码区域)，从而阻遏翻译。除此之外，miRNA也可以切割完全互补的mRNA。加工过程siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂miRNA是不对称加工,