营养物对新月组织培养的影响

营养物对新月组织培养的影响

玫瑰是蔷薇科的一种花卉，来自中国。它是中国最早的花之一。月季于17世纪传入欧洲，现已遍布世界各地，目前世界上已有两万多个月季品种，种类数量居所有观赏花卉之首。月季花容秀美、花色绚丽、芬芳馥郁、四季常开，故有“花中皇后”的美称。月季被多个国家选为国花，我国也有40多个城市将月季定为市花。植物组织培养技术（以下简称组培）是应用无菌操作方法，培养植物的离体器官、组织或细胞，使植株再生的一种无性繁殖手段，此方法是在20世纪30年代才出现的。对月季而言，虽然早在1980年Hasegawa就以攀援月季“Improvedfire”的茎尖或休眠芽为材料，在MS培养基上建立了试管苗无性系，且其他一些研究者也先后用月季的茎尖和腋芽诱导出了完整的植株。但目前月季的繁殖技术依旧沿袭了传统的扦插、嫁接等方法，这些方法限制了月季的繁殖量，不能满足月季工厂化大生产发展的需要。故对月季组织培养技术的进一步研究及市场化是现在该技术发展的方向。对于月季组织培养技术而言，茎段培养是最直接、最简便、成苗速度最快的一种手段，几乎所有研究组织培养的工作者都会利用这种培养方式。茎段培养的月季的再生方式是通过顶芽和腋芽的发育实现的，顶芽和腋芽在离体培养中都可被诱导而发育，单个的芽可萌发出单一的苗或多个苗。月季离体快速繁殖也可通过愈伤组织诱导不定芽的分化、体细胞胚胎发生、花药培养来实现。随着月季组织培养技术的发展，研究者也探讨了影响月季离体快速繁殖的因素，发现这些影响因素不是单一的，其中主要影响因素有植物生长调节剂、外植体、培养基和培养条件4个方面，本文就目前国内外对这些影响因素的研究作一综合讨论。1细胞分裂素对变更生长素的作用影响月季组织培养的植物生长调节剂主要有细胞分裂素（如BA、ZT、ZR、2iP、ipA和TDZ等）、生长素（如NAA、IAA和IBA）和赤霉素（GA3)3种。细胞分裂素参与克服顶端优势的过程，因而能促进侧枝的萌发和生长，试管中嫩芽的繁殖主要是细胞分裂素影响的结果。Bressan,P.H在研究“GoldGlow”侧芽的发育的影响因素时发现，采用6-BA含量为0.03～0.3mg/L的MS培养基时可促进“GoldGlow”侧芽的发育，但当BA含量超过0.3mg/L则显著推迟芽萌发，毕艳娟也报道了低浓度的细胞分裂素（BA、ZT）有利于提高月季的萌芽率。不同种类的细胞分裂素对月季茎增殖的影响也不同。C.A.M.Marcelis等在添加相同浓度（0.44μmol）的细胞分裂素BA、ZT、KT、ZR、2iP、ipA的各培养基上培养了“SweetPromise”。其研究结果表明KT实际上对茎增殖没有多少影响；而BA、ZT、ZR都可显著促进茎的重量和长度增加；2iP和ipA虽也可促进茎的形成，但效果不如BA、ZT、ZR的明显。细胞分裂素配合一定的生长素可共同促进月季侧芽的萌发与生长。在茎增殖阶段，配合细胞分裂素使用的生长素，最常用的是NAA。在6-BA质量浓度相同的情况下，随NAA质量浓度的升高（0.05～0.20mg/L），月季小芽生长速度加快。但NAA用量同时会影响芽增殖速度，当NAA用量达0.1mg/L以上时，芽增殖的速度有下降趋势。一般的说，培养基中BA和NAA两者浓度过低或过高均不利于试管苗的存活。除NAA外，常用的细胞生长素还有IBA和IAA，它们对幼芽分化的影响是有明显差异的：在同样含有2mg/LBA的MS培养基上分别添加相同浓度（0.1mg/L）的IBA和IAA培养切花月季萨曼沙茎段、其幼芽分化百分率前者为80.0%，后者则为68.0%。在培养基中添加GA3可促进幼苗茎的伸长生长，还对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用：将月季嫩茎接种到附加2.0mg/L的BA、0.1mg/L的NAA和2.0mg/L的GA3的MS培养基上培养5周后，芽增殖倍数达7.86，远远高于其他没有添加GA3的处理组合。还有一类具有细胞分裂素活性的物质噻二唑苯基脲（TDZ），其促进芽繁殖的活性比细胞分裂素高得多。AnllKumar等用分别添加TDZ(1.0或2.5μmol）和BA(1.0～12.5μmol）的培养基培养了Rosedamascena，对比结果发现TDZ更能促进芽和茎的生长以及茎的伸长。同时Barna的研究表明5～10μmol的TDZ可以明显促进RosehybridaL.的茎增殖。在茎增殖阶段，细胞分裂素浓度过高对下一步的生根培养有影响，增殖用的BA含量愈高，对生根的抑制愈严重。在生根阶段，细胞分裂素对生根和移栽有抑制效应，使用0.3mg/L或更高浓度的2iP培养基进行月季组织培养，组培苗一般无法生根，即使2iP浓度较低时能形成一些根,在移栽时也会失败。因此，一般在月季生根培养基中都尽可能降低细胞分裂素的浓度，而使用一定量的生长素。但生长素浓度过高也同样会抑制月季根的形成，只有选择适宜的生长素浓度才能有效地促进根的生长。Hasegawa指出，用IAA诱导生根，浓度只能在1mg/L以下，IAA浓度过高根的诱导有下降趋势。对NAA而言，浓度为0.5mg/L时对月季的诱导生根和提高移栽成活率有良好效果。在切花月季萨曼莎的组织培养试验中，为保证生根率，IAA、IBA、NAA的浓度均需做适当控制。2外植体的大小、培养时间、培养时间对茎干和茎段生长的影响外植体的大小以及取材部位、时间等直接影响月季组培的效果，选择合适的外植体是月季组培成功的重要保证。外植体很小时，有利于培养脱毒的植株。对月季的杉树坏疽环斑病毒（Prunusnecroticringspotvirus,PNRSV）可通过茎尖培养的方式达到脱毒的目的，如果单纯为了快速繁殖，可用大的茎尖或茎段进行离体培养，这时外植体的大小决定了茎尖的成活比例。一般说外植体愈大，成活率愈高，成苗时间愈短。茎尖在1～10mm长短时，对形成多芽苗最有效，不但多芽苗所占百分率高，而且每个茎段的侧枝数也比较多。外植体的大小同时影响外植体自身的发育和月季组培苗茎的增殖，外植体的长度在9.0～10.0mm，直径在3.0～3.5mm范围时，茎的增殖和发育是最好的。但Horn对某几种月季进行微繁实验时发现外植体的大小对茎的增殖、叶片数目没有影响，其他一些研究者对只有一个茎节的“SweetPromise”进行组织培养中得到了类似的结论。外植体的取材部位对芽的萌发也有影响。“GoldGlow”和“Improvedfire”月季的侧芽如果在不含激素的培养基上进行组培，可发现在枝条顶部和基部的芽发育慢，而枝条中部的芽发育快。MaYan等在研究中发现靠近外植体顶端的芽较其他部位芽的发育慢。在茎尖脱毒培养时，由嫩茎的顶芽得到的外植体成活率高于腋芽。在实际工作中由于顶芽数量少，故月季的组培依旧常常使用腋芽作为外植体，这时一般需要进行茎切除顶芽（摘心）以打破顶端优势、促使腋芽健壮生长，以促进嫩茎的增殖。此外，外植体的取材时间及培养所需时间对月季嫩茎的发育和增殖也有影响。对于“Bulgarianrose”而言，选取外植体的最佳时间是冬季（1～3月）；而“Improvedfire”月季的培养时间以28d继代一次较好，超过28d，茎的数目就不再增加了。3培养基的碳源与培养模式用于月季的基本培养基种类很多，如B5、N6、WPM和MS培养基等。众多培养基中以MS培养基的效果为最好，广泛用于月季的离体快速繁殖中。培养基的培养成分（主要是各类无机盐浓度）及物理性能（pH值、糖分以及固化支持物）会影响月季的组培。对MS培养基的成分及物理性能进行合理的选择会提高月季组织培养的成功率。MS培养基中无机盐离子浓度因月季培养阶段的不同而有不同：1）茎段培养阶段，将带有腋芽的嫩茎接种到不添加任何激素类物质的MS和1/2MS培养基上，两周后，MS培养基上的腋芽生长，而在1/2MS培养基上的腋芽几乎不萌发或发育不良。通过提高MS培养基中氯化钴的浓度，并用硫酸铵代替硝酸铵培养“Bulgarianrose”，可使其茎的生长状况得到改善。同时有报道认为在MS培养基中添加硝酸银可以缓解叶片衰败并提高茎段侧芽的生长。2）诱导生根阶段，一般要求较低的MS培养基无机盐离子浓度。Skirvin等在用（ForeverYours）月季做生根试验时发现，采用1/4MS培养基，不加生长素即可以促进生根。Hyndman认为MS培养基中的氮盐含量是影响月季生根的主要因素，把MS培养基中氮素含量从60mmol/l减少到7.5mmol/L（相当于1/8MS中的氮素含量）时，嫩茎生根效果良好，保持7.5mmol/L的氮素含量，MS培养基中其它无机盐的浓度减少到原配方的1/16，对生根没有影响；但氮素含量过高会引起月季组培苗的生根不适。3）在月季愈伤组织和体细胞胚胎的培养过程中，MS培养基中微量元素要做适当调整：提高铜含量或降低锰、锌、碘的含量能更好的促进胚状体的发育。4）月季花药培养过程中在MS培养基中添加硼酸可提高萌芽率，添加硝酸钙则降低萌芽率。培养基的pH值可通过影响培养物的营养元素的吸收、呼吸代谢、多胺代谢、DNA的合成和植物激素进出细胞等作用直接或间接地影响愈伤组织形成及植物形态建成。一般而言，培养基的pH值在5.5～6.0之间时月季的组培苗生长良好，但我们在对微型月季“小太阳”（SonnenKind）进行组织培养试验时发现控制培养基的pH值为6.3～6.8，其芽分化效果较好，且pH6.3的培养基培养出的微型月季叶片颜色也较其它培养基（pH值分别为5.3、5.8和7.3）得到的月季叶片颜色绿，且小苗长势良好。培养基的pH值并非保持恒定，在培养基准备阶段（尤其是高压灭菌后）和月季的生长过程中都发生着变化，实验中需要不断对培养基的pH值进行实时测量和调整。培养基pH值不断变化的一个重要影响因素是NO3-和NH4+之间供应与吸收的不平衡。在植物生长过程中，培养基的pH值一般是先降低后升高的。几乎所有的培养基中都要加入糖。糖作为碳源为细胞提供合成新化合物的碳骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源；培养基的渗透调节也是靠糖来完成的。不同类型的月季，其组培要求的碳源和糖浓度有所不同。月季组培最常用的碳源是蔗糖。在丰花月季的组织培养中，初代培养的蔗糖含量为5%，继代培养的蔗糖含量为3%时培养效果较好，而Scotti等进行月季继代培养时所用蔗糖浓度为2%。对于“Motrea”月季来说，使用葡萄糖作碳源更有利于芽的发育。从生理上说，培养基中的固化支持物并非完全不起作用的物质，它含有能影响外植体生长的物质。培养基中大约有十分之九的固化支持物是琼脂，月季组织培养中，琼脂的种类和产品质量的差异会影响芽的发育与增殖：月季“Motrea”的侧芽在纯净的琼脂BD(BectonDickinson）上发育较好，而在Merck1614和不纯净的BD上发育较差，但目前尚未有较好的方法检测琼脂的质量。现在已经有人成功地利用其它支持物替代价格昂贵的琼脂，月季试管苗在蛭石作固化物的培养基上的生根率几乎与琼脂作固化物的培养基上的一样,而移栽成活率却高于琼脂作固化物的培养基培养的月季。4不同光照、光照和光通密度对缺失植株影响月季组培的外界条件还有光通密度（PPFD）、温度以及添加剂等，简要摘述于下。光通密度是影响月季离体快速繁殖的一个重要因素。WuAn-Na等试验发现“Landora”月季的离体叶片培养，在PPFD为35mumol/m-2sec光照强度下培养时，叶片气孔大大张开，而在PPFD为70mumol/m-2sec的光照强度下培养时，叶片气孔开度变小。在强光条件下，嫩茎增殖最多，但叶子衰老的程度也最显著。光通密度对种植成活率影响不大，17μEm-2s-1,66μEm-2s-1和148μEm-2s-1的光照条件下植株的成活率都在80%左右。月季茎增殖受温度的影响较小，但根的发育对温度的变化相当敏感。21℃下根的生长远远优于16℃和26℃。而在16～26℃范围内，月季苗的移栽成活率基本恒定。光周期为每天16小时，温度保持在21℃，黑暗时温度是16℃或21℃，对月季“改良火焰”品种茎的增殖最为有利。当黑暗时温度是11℃或16℃时，对嫩茎的生根最为有利。在月季的组织培养中，还有一些物质影响了月季嫩茎的增殖及发育，主要包括：1）根皮苷。根皮苷是一种天然的酚类化合物。在低浓度时，能促进细胞分裂，加快芽和根的分化速度，适量的根皮苷还可提高芽和根的分化率，促进愈伤组织重量增长，在根皮苷浓度1～3mg/L时，月季芽原基愈伤组织块增重非常迅速。根皮苷不能单独起作用，必须在有细胞分裂素存在的条件下才能对离体器官培养产生作用。2）三碘苯甲酸（TIBA）。TIBA是一种生长抑制剂，但适当浓度的TIBA也可以促进嫩茎的增殖。在“改良火焰”的组织培养试验中，浓度为1mg/L的TIBA对促进嫩茎增殖的效果最好。3）活性炭作为一种吸附剂，在植物组织培养中可起到抑