第二章-动物检验检疫技术

第二章动物检验检疫技术

细菌病毒

真菌

病原性微生物：

立克次氏体寄生虫昆虫采集运送

检验检疫技术

处理保存方法第一节检验检疫样品第二节细菌分离及鉴定第三节病毒分离及鉴定第四节其他病原微生物分离及鉴定第五节寄生虫检查第六节现代生物技术在动物检验检疫中的应用第一节检验检疫样品一、病料采集和运送二、病料的保存三、病料的记录、包装和运送方法1、在采取病料前必须对被检动物可能患有何种疫病作出初步诊断。2、采取病料所用的容器、手术器械，均应灭菌后才能使用，采样时应无菌操作。3、解剖前检查：凡是急性死亡的动物，没解剖之前，必须用显微镜检查其血液抹片或组织触片当中是否有炭疽杆菌。如果怀疑是炭疽，不能随意解剖，可采取血液检查。只有在确定不是炭疽后，方可进行剖检。解剖时，采取有病变的脏器或者组织送往实验室，以便证明其病因。

4、取材的时间要早：动物死亡之后，要立即采取相关病料，最好不要超过6h，否则时间过长，由于肠内其他细菌侵入，致使尸体容易腐败，不利于病原菌的检出5、为了提高病原微生物的阳性分离率，采取病料的种类，应根据不同的疫病，相应的采取其脏器或内容物。在无法估计是某种疫病时，可进行全面的采取。二、病料的保存（一）细菌检验材料的保存将采取的脏器组织块，保存于饱和的氯化钠溶液或30%甘油缓冲盐水溶液中，容器加塞封固。液体装在封闭的毛细玻管或试管运送。（二）病毒检验材料的保存将采取的脏器组织块，保存于50%甘油缓冲盐水溶液或鸡蛋生理盐水中，容器加盖封固。（三）病理组织学检验材料的保存将采取的脏器组织块放入10%福尔马林溶液或95%酒精中固定；固定液的用量为送检材料的10倍以上，起码要淹没住。如用10%福尔马林溶液固定，应在24h后换新鲜溶液一次。严冬季节为防止病料冻结，把固定好的组织块取出，保存于甘油和10%福尔马林等量混合液中。三、病料的记录、包装和运送方法（一）送检单病料送往检验室时，要附送病料送检单，该单需复写3份，其中1份存根，两份寄往检验室，等检查完毕后，退回1份。（二）病料的包装和运送1、液体病料最好收集在灭菌的细玻璃管中，管口用火焰封闭，封闭时，要注意不能使管内的病料受热。然后将封闭的玻管用废报纸或棉花包裹，装入大一号的试管中，再装入木盒中运送。

2、盛放组织或脏器的玻璃仪器，包装时要细致结实，最好是容器套容器。就是里面的小容器加塞封口，外面的大容器内部衬垫废纸之类的材料，这样不至于使里面的小容器破碎。气候炎热时，就需要加冰块物理降温，但是也不能使病料冻结。3、病料装好后，要尽快送到检验部门。途中要避免病料接触高温及日光。第二节细菌分离及鉴定

细菌分离及鉴定就是采用人工的方法使细菌在适当的环境和营养基质中生长繁殖，获取纯种、进行鉴定与研究等的过程。一、无菌技术无菌技术操作要点：（1）无菌室在使用前，先用紫外灯照射30~60min进行空气消毒。（2）在进行接种、倾注琼脂平板时均须在无菌室、超净工作台或接种罩内操作。（3）用接种环分离和移种细菌时，使用前后均需采用火焰灭菌。

（4）凡是打开或关闭无菌试管和烧瓶时，管口要通过火焰2~3次，用来杀灭可能吸附在管口或瓶口的细菌。开启后的试管和烧瓶应尽量靠近火焰，而且要求瓶口千万不要向上和长时间暴漏在空气中。操作时，千万不能造成含菌材料污染台面和其他物体。（5）所用的物品都要进行严格的消毒，在使用过程中不得与未经灭菌的物品接触。（6）从动物体内抽血或接种时，要先剪去局部毛后，再进行常规消毒。（7）工作完毕，室内空气用紫外灯照射30min、实验人员认真消毒洗手。（8）如果不慎造成污染，要及时用消毒液处理。二、接种工具接种环

接种工具接种针耙形接种针的针尖部分

刀形锄形灭菌程序：手持接种工具的绝缘端，将镍丝直立在火焰上逐渐向下移动，把工具烧红，再平持工具，将金属柄往返在火焰中通过3次灭菌，冷却使用。用完后，立即将染菌的镍丝在火焰（内焰）中加热，烤干环（针）端附着的细菌或标本，然后再移入火焰中灼烧灭菌，最后将金属柄在火焰中往返通过3次。如果直接将环（针）在火焰中燃烧，则有污染环境或感染的危险。三、操作环境（一）接种罩供接种（或转种）细菌用的玻璃或有机玻璃制成的空间，它的样式可根据需要自行设计和选择。接种罩在使用之前，要先用消毒剂擦拭，或用紫外灯照30min。操作结束后，也应立即清理内部，并作消毒处理。（二）无菌工作台也叫超净工作台或生物安全柜，是在接种罩的基础上设计出来的一种无菌空间。（三）无菌室无菌室是在实验室内安装的用于无菌操作的小室。无菌室内应有空气过滤装置、紫外线灯、照明灯、电源灯设施。无菌室内需保持整洁，进入无菌室，要穿隔离衣帽和专用鞋，用前需紫外灯照射30~60min消毒，实验结束后，要擦拭干净台面、地面，紫外灯照射消毒，使无菌室保持无菌状态。第三节病毒分离及鉴定一、检材的采集与送检冰块干冰病变组织——50%的甘油缓冲盐水二、病料的处理将分离病毒的材料制成1:5~1:10的乳剂，并且每1mL加入青霉素和链霉素各1000单位，主要目的是抑制可能污染的细菌，然后放置冰箱中2~4h，再进行离心沉淀，取上清液作为接种材料。三、病毒的分离培养病毒本身没有完整的生物合成酶系统，只能依靠宿主细胞的酶系统与营养才能繁殖，因此，培养病毒需要接种动物、鸡胚或者组织细胞。（一）动物接种培养动物接种场地的选择→实验动物的种类→动物选择→常用动物实验技术（二）病毒的鸡胚培养鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适用于许多人类和动物病毒的生长繁殖。鸡胚的选择和孵育→接种前的准备→鸡胚接种→接种后的检查→鸡胚材料的收获（三）病毒的细胞培养细胞培养——通过机械解离或消化等方法将组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给予必要的生长条件，模拟体内生长环境，使其在体外能继续生长于繁殖，称为细胞培养。细胞培养分为原代细胞培养和传代细胞培养。原代细胞的培养——用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，370C孵育1~2d后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞。传代细胞培养——是指需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养的过程。病料处理→病毒分离、繁殖→细胞病变（CPE）观察第四节其他病原微生物分离及鉴定一、螺旋体螺旋体是一类菌体细长、柔软、弯曲呈螺旋状、能活泼运动的原核单细胞微生物。二、立克次氏体立克次氏体是介于细菌和病毒之间的一类微生物。除少数成员外，大多数为严格的细胞外寄生性微生物。三、支原体支原体是能在无活细胞培养基中繁殖的最小微生物，它是一类无细胞壁，仅由三层薄膜组成的细胞膜，胞质内有颗粒状核糖体，双股DNA的原核细胞。四、衣原体衣原体是一类专性严格的细胞内寄生生活的微生物，不能在细菌培养基上生长繁殖。第五节寄生虫检查一、虫卵检查法虫卵漂浮法——相对密度较小的虫卵，根据虫卵的相对密度，配制相应的漂浮液，掌握适当的离心力进行离心，即可以在漂浮液的液面上收集到虫卵。用水洗沉淀法——对相对密度较大的虫卵，多用水洗沉淀法，在沉渣中收集检查虫卵。二、虫体检查法1、蠕虫的成虫检查法：成虫的虫体检查，在生前主要用于绦虫病的诊断；死后剖检（或抽样剖检）几乎可用于所有蠕虫病的检查。2、蠕虫的幼虫检查法：幼虫的虫体检查，多用于非肠道寄生虫或通过虫卵不易鉴定寄生虫。如贝尔曼氏幼虫检查法用于检查肺线虫；血液压片法和集虫检查法用于检查丝状线虫病。3、螨虫检查法：分皮屑内死虫检查法和皮屑内活虫检查法。前者可采用漂浮法或沉淀法，适用于初步诊断；后者可采用直接检查法或温水检查法，适用于确诊。三、免疫学检测方法1、免疫沉淀技术：单向免疫扩散法、双向扩散法、免疫电泳法等；2、免疫荧光技术：结合了免疫学反应的特异性和在黑色背景中发光物质易被发现等优点；3、免疫酶技术：酶联免疫吸附试验（ELISA）、斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA）；4、免疫凝集技术：间接的细胞凝集试验（IHA）、乳胶凝集试验等。四、分子生物学检测方法主要用于精确的定性分析或衡量病原的检测，包括核酸探针技术和PCR（聚合酶链式反应）技术。这两种技术在寄生虫的检测中多局限于同一种属中不同虫种或虫株的鉴别。第六节现代生物技术在动物检验检疫中的应用抗原-抗体反应的免疫血清学技术现代生物技术

病原核酸检测的分子生物学技术

免疫血清学技术——中和试验、凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、免疫荧光抗体技术、放射免疫技术、免疫酶标记技术、胶体金标记技术、免疫电镜技术等。

聚合酶链式反应核酸杂交寡核苷酸指纹图谱分子生物学技术限制性片段长度多态性随机扩增多态性DNADNA序列测定DNA芯片其中PCR和核酸杂交技术具有特异、敏感、快速、适于疫病早期诊断和大量样品的检测而成为分子生物学诊断技术中最常用和最具应用价值的方法。二、免疫学技术在动物检验检疫中的应用（一）病原菌的检测常规细菌疫病的诊断和检疫方法——细菌分离培养、菌落培养特性、菌体染色镜检、生化试验。优点：快速、又灵敏，不但可以直接进行细菌菌种的鉴定，而且可鉴定种内的血清型和血清亚型，成为检疫动物细菌疫病的主导方法。缺点：交叉反应较严重、假阳性多、灵敏度偏低，所以不能直接对这些样品进行分析和检测，检测前需进行富集培养，延长了检测时间。（二）药物残留的检测抗生素（青霉素、庆大霉）磺胺类（磺胺甲恶唑（SMZ））残留药物呋喃类（呋喃唑酮（痢特灵）、喹诺酮类（诺氟沙星）激素（性激素、胰岛素）转基因类药物目前用的最多的方法就是ELISA（酶联免疫吸附剂测定），它前处理简单，可同时分析多个样品，分析时间短，灵敏度高，因此是目前最理想的残留筛选性分析方法之一。三、分子生物学技术在动物检验检疫中的应用（一）应用于病原细菌的检测主要应用的有两种方法，一是PCR，另一种是核酸探针技术。PCR优点：不仅检测时间短、灵敏度高，还可以检出一些依靠培养法不能检测的微生物种类。该技术已用于病原菌的检测，如大肠杆菌、布氏杆菌、结核杆菌等的鉴定和分型中，只要核酸序列是清楚的，就可以检测任何的病原体。核酸探针技术也已应用于检测大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等的。缺点：检测一种