常用药物检测方法的研究进展

常用药物检测方法的研究进展

目前，靶点药物的检测方法主要包括化学检测法、光谱法、色谱法和免疫法。化学法灵敏度低，样品需要量大；光谱法仪器简单，测定快速，但易受体内代谢物质的干扰，选择性差；色谱法测定准确，但提取过程复杂，需要有经验的技术人员；免疫法可直接测定生物样品，需样量少，操作简便，灵敏度高，特异性强，是国际上通用的筛选方法。目前常用的免疫学分析技术类型主要有：(1)放射免疫分析(radioimmuno-assay,RIA)，(2)酶增强免疫分析技术(enzyme-multipliedimmunoassaytechnique,EMIT)，(3)荧光偏振免疫分析(fluoprescencepolarizationimmunoassay,FPIA)，(4)金标免疫分析(golden-labledimmunochromatograpicassay,GICA)，(5)酶联免疫吸附分析(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)，(6)散射免疫比浊抑制分析(nephelometryassay,NA)等。本文简要介绍常用的滥用物质、滥用药物检测样品分类和前处理方法及上述免疫分析法，并就其近年来在药物滥用检验中的应用进展作一综述。1一般滥用物质1.1氢埃托啡、地芬诺酯、合成吡啶类连续使用后易产生依赖性，即成瘾的药品，共有118种，其中我国目前生产的仅九种：可卡因(cocaine)，二氢埃托啡(dihydronetorphine)，地芬诺酯(苯乙哌啶diphenoxylate)，芬太尼(fentanyl)，美沙酮(methadone)，吗啡(morphine)，阿片(opium)，乙基吗啡(ethymorphine)和吗啉乙基吗啡(福尔可啶pholcodine)。1.2egeege直接作用于中枢神经系统，具有兴奋或抑制作用，连续使用能产生依赖性的药品。包括第一类精神药品、第二类精神药品、兴奋剂、致幻剂等。(1)第一类精神药品共47种，其中我国目前生产的有六种，即哌醋甲酯（利他林methylphenidate），可可巴比妥(secobarbital)，安钠咖(caffeineandsodiumbenzoate)，咖啡因(caffeine)，丁丙诺非(buprenorphine)和复方樟脑酊。(2)第二类精神药品共72种，我国目前生产的也只有20个品种。分别是：异戊巴比妥(amobarbital)、去甲麻黄碱(苯丙醇胺cathine)、喷地佐辛(镇痛新pentazocine)、阿普唑酮(alprazolam)、安非拉酮(amfepramone)、巴比妥(barbital)、氯氮卓(利眠宁chlordiazepoxide)、氯硝西泮(clomzepam)、地西泮(安定diazapam)、艾司唑仑(estazolam)、氟西泮(flurazopam)、甲丙氨酯（眠尔通meprobamate）、硝西泮(硝基安定nitrazepam)、匹莫林(pemoline)、苯巴比妥(Phenobarbital)、三唑仑(triazolam)、氨酚待因(paracetamolandphosphateⅠ)、氨酚待因Ⅱ号(安度芬paracetamolandphosphateⅡ)、氯芬待因和丙氧氨芬。(3)兴奋剂：包括苯丙胺(安非他明amphetamine)、右旋苯丙胺、甲基苯丙胺、二甲基苯丙胺、苯环啶、丙氧酚等。(4)致幻剂：包括大麻和大麻精等。1.3其他包括烟草(tobacco)、酒(alcoholicdrink)和挥发性有机溶剂(organicsolvent)等。2血清、历史液膜目前常用的滥用药物检测样品主要有：血样（一般为血清或血浆）、尿液（一般为新鲜尿液）、毛发（一般为头发）、唾液；此外，也有用汗液、胃液和乳液等其它体液，一般只在特殊情况下使用。3不适当的药物检测前处理方法3.1萃取液体的方法利克罗夫县，LLE)LLE法选择性好，灵敏度也较高，但易产生乳化现象，导致回收率降低，且操作起来不易规范化。3.3fesfe的应用fluidextraction,SFE)SFE可用于多种化合物的提取，特别适用于组织样品中毒物的提取净化，具有平衡快、分析时间短、分离效率好等特点。3.4免疫亲和提取法pmeAME具有选择性高、回收率高、操作简便和从稀溶液中富集被测药物等优点。4免疫分析法对抗药滥用的应用4.1掳毒者尿相对于一般毒力1959年美国的Yalow和Berson首先使用放射性核素标记胰岛素从而创立了放射免疫分析法。RIA法是将核素标记技术与抗原抗体反应结合起来的一种微量分析方法。由于该方法的灵敏度高（可检出ng级至pg级甚至fg级的微量物质）、特异性强、重复性好、准确性佳、经济、药盒种类多、标本和试剂用量少，测定方法易于规范化和自动化等诸多优点，因此，它在医学和其它生物学科的研究领域和临床实验诊断中得以广泛应用。RIA的主要缺点有：(1)检测中有放射性污染，对操作人员有一定的辐射损害；(2)放射性废物处理上的困难和对环境有一定的污染。ZhuyinLi等应用RIA法研究了不同储藏条件下（包括光照、温度、酸碱度和不同容器）尿样中麦角酰二乙胺的浓度变化。刘锐克等建立了一种准确、可靠、简便、快速地定量检测甲基苯丙胺(MA)的RIA方法。方法灵敏度达1ng·mL-1，与MA有100%反应，与相关药物的交叉反应小或无交叉反应。苏木金等应用RIA法分析了海洛因滥用者唾液中吗啡的含量；并报道了122例海洛因滥用者头发中吗啡含量检测的RIA法，结果显示：滥用者头发中吗啡含量为713.04±29.82ng·mL-1,30例正常健康对照组头发中吗啡含量为1.21±0.91ng·mL-1，两组差异非常显著(P<0.01)。周文华等应用RIA法检测147例海洛因成瘾者血清游离吗啡和总吗啡浓度，结果显示：轻型、中型和重型海洛因成瘾者血清游离吗啡和总吗啡浓度分别为22±15ng·mL-1和134±63ng·mL-1;44±24ng·mL-1和324±154ng·mL-1;101±47ng·mL-1和663±180ng·mL-1，与吸毒时间、吸毒剂量以及戒断症状的评分值呈正相关。宋锦朝等应用RIA法检测嫌疑人体液中吗啡类毒品，方法灵敏度为1.6ng·mL-1，直线方程为y=211.1x-3.62,r=0.9998。低变异值6.2%，高变异值2.6%，回收率为93%～97%。Dugan等用RIA法研究了236例尿样中9-羧基-大麻、苯丙胺、甲基苯丙胺、吗啡、可待因、可卡因、苯甲酰牙子碱和苯环利啶等药物在-20℃存储条件下12个月内的浓度变化情况，认为虽然所有的浓度范围均有所改变，但大多数在初始浓度的±25%范围内，变化大小与初始浓度无关。查浩民等采用RIA法和AC快速尿液检测法测定尿中吗啡含量。结果显示：吸毒者停止吸毒后1～3d，阳性率为100%，与之相比，AC快速尿液检测法假阴性率为6.3%以上，假阳性率为16.0%。RIA法可用于分析海洛因滥用者尿吗啡排泄规律，能较准确反映尿中吗啡含量，可提高戒毒场所对吸毒者的鉴定水平。丁继超等应用RIA法连续测定65人次自愿戒毒患者在使用美沙酮脱毒治疗中，每日尿样总吗啡的含量，从而得出在不偷吸的情况下，尿检转阴时间为3.51±1.12天，与吸毒时间长短及末周每日吸毒量大小无关。梁峰等应用RIA法和Visualine-Ⅱ尿液检测盒分析检测百色地区1996-1997年海洛因依赖者尿液吗啡含量。结果男女海洛因依赖者尿液吗啡含量分别为815.36±216.15ng·mL-1和512.15±211.26ng·mL-1;Visualine-Ⅱ法均呈阳性反应，符合率为100%。正常对照组男女尿液吗啡含量分别为26.81±11.28ng·mL-1和31.52±12.36ng·mL-1，接近国内确定的临界值(<30ng·mL-1)；Visualine-Ⅱ法均呈阴性反应。海洛因依赖者尿液吗啡含量显著高于正常对照组（P<0.01）。Narongchai等用RIA法测定了海洛因给药后尿中吗啡含量的持续变化，发现给药后连续7天尿吗啡的水平是可测的，它的逐日下降率分别为88.4%、74.2%、64.2%63.3%、57.1%和44.8%。4.2aa的检测方法是将抗原抗体反应的特异性和酶的高效催化作用相结合，由此建立的一种非放射性标记免疫检测技术。它融合了免疫荧光和RIA测定方法的敏感、特异和精确等优点，又弥补了二者的某些不足。因此，它问世虽短，但发展十分迅速，各种检测方法日新月异。已成为目前使用最多的一类免疫学实验技术，应用广泛，涉及医学和生物学的各个领域，是目前临床上免疫标记领域的主流检测技术之一。目前，临床上已有许多RIA试剂被EIA等非放射性核素标记的免疫分析技术所取代，最近几年，在EIA中又引入生物素-亲和素放大系统，使EIA检测灵敏度接近或超过RIA，达到了10-19mol·L-1，而且包括加样、孵育、洗涤、比色、测定数据处理等整套全自动处理功能的实现，又使EIA法彻底解决了操作烦琐，技术要求高等问题，使其临床应用得到进一步加强。其不足之处是(1)实验中使用有潜在致癌性的酶显色底物；(2)酶促反应的不稳定性；(3)与发光免疫技术相比，灵敏度稍逊一筹。4.2.1酶增强免疫分析1974年Syvaco首先报道了EMIT，并成功地应用于临床；在EMIT中，酶标记抗原同时具有抗原活性和酶的活性，酶标记抗原与抗体结合后，因抗体与酶密切接触，影响酶的活性中心，使酶的活性明显被抑制。假如非酶标记抗原（标准或被测样品中的抗原）与酶标抗原互相竞争与抗体结合，使反应液中有酶标记的抗原抗体结合物减少，游离的酶标抗原增加，酶活性被释放，因而称为酶增强免疫分析技术。也有EMIT是酶活性随着抗原浓度增高而减弱的。田桢干等应用EMIT法追踪监测海洛因依赖者尿液转阴时间，连续检测60例被强制戒毒者每日尿吗啡含量，测定在不连续吸食的情况下，尿液转阴时间为(3.833±0.436)天。Hino等应用EMIT法检查血液中阿片、大麻和苯丙胺等的含量，发现EMIT法可用于血液低浓度滥用药物的检测。4.2.2血清和山鱼血流学检测酶联免疫吸附分析是以酶作为标记物、以抗原抗体免疫反应为基础的固相吸附测定方法。整个测定过程中，抗原抗体结合反应在固相支持物上进行，反应结果是以酶与其底物作用后显色或产生荧光/发光强度来判断的，显色或产生荧光/发光强度与临床标本中待测物的浓度相关。由于ELISA技术无污染，操作简便，项目易于开发等优点，加上已有的自动化性能，已受到临床实验室的重视，并广泛应用于常规检验。马金泉等建立了一种血清和尿液中微量吗啡浓度酶免疫定量检测法。方法的标准曲线工作范围为0～900ng·mL-1，回归方程为y=0.9924x+0.1228，检测限为7.8ng·mL-1，批内RSD=3.8%，批间RSD=4.9%，平均回收率为98.9%，与RIA相比(n=50)，r=0.9948，相关性良好；并应用该法对临床53例阿片依赖性住院患者和50例正常人进行了血清和尿液中微量吗啡检测。结果：患者血清标本吗啡浓度为268.0～712.0ng·mL-1(平均318.0ng·mL-1)，尿液标本吗啡浓度为251.0～834.0ng·mL-1(平均322ng·mL-1)，均呈阳性反应；正常健康人血清和尿液标本吗啡浓度检测均呈阴性反应。Kemp等应用ELISA法检测血液中阿片类物质，发现阿片类物质ELISA法的最佳临界值为20～50ng·mL-1。4.3荧光标记药物与抗体的标准曲线是利用荧光素经单一波长（蓝光）的偏振光照射后吸收光能，释放出相应的偏振荧光，荧光偏振程度与荧光分子大小呈正比的关系而建立的免疫分析技术。FPIA用于测定某种药物（小分子）时，待测药物和荧光标记药物与相应抗体（大分子）进行竞争结合。当待测药物浓度高时，荧光标记药物与抗体结合少，多呈游离的小分子状态，分子小则运动速度快，荧光发射分散，荧光偏振程度较低；如果待测药物浓度低，荧光标记药物与抗体结合形成标记药物-Ab复合物，分子大，运动速度慢，荧光集中，荧光偏振程度较高，即待测药物与荧光偏振程度呈反比关系。通过药物标准品与荧光偏振程度建立标准曲线，可检测待测药物浓度。目前，已有数十种药物能采用FPIA进行分析。FPIA法与其它免疫荧光分析法相比，具有以下优点：(1)简便的均相测定方法，易于快速、自动化测定；(2)血清样品可直接用于测定，样品用量少；(3)灵敏度高，精密度好，线性范围宽，结果准确。唯一不足的是检测设备较为昂贵，难于普及。Kell等采用FPIA法测定血浆中美沙酮的含量，方法线性范围为10～1600ng·mL-1，检测限为25ng·mL-1。4.4药物滥毒的检测金标免疫分析技术是一种以胶体金作为示踪物，用于抗原抗体反应的一种新型标记免疫测定技术，在二十世纪70年代初期由Faulk和Taylor始创。由于胶体金能与多种生物大分子结合，已成为继荧光素、放射性核素和酶之后，在免疫标记技术中常用的一种非放射性核素示踪物。目前，金标记技术除用于免疫组化染色外，金标记测定已与膜载体配合，形成特定的模式，如斑点免疫渗滤试验(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)和斑点免疫层析试验(dotimmunogoldchromatographicassay,DICA)等。DICA技术由于标记物制备简单，方法特异、使用方便、测定快速、易于普及，且无需用放射性核素或有潜在致癌性的酶显色底物，所以已广泛应用于临床检验工作中。邓艳萍等采用胶体金监测试剂盒和药毒物广筛鉴定LAB系统（TOXI-LABASSYSTEM）对药物滥用嫌疑患者尿样进行分析，结果用试剂盒检测发现，21例中甲基苯丙胺阳性6例，苯丙胺阳性5例，甲基苯丙胺和苯丙胺同时阳性4例；经TOX-I-LABASSYSTEM检测，发现滥用的兴奋剂分别是甲基苯丙胺和亚甲基二氧苯丙胺或两者混合。苏木金等采用美国ABI公司SurestepTM快速尿液毒品检测试剂盒，对30名海洛因依赖者脱毒过程中逐日尿液标本进行检测，并以30例健康者尿液进行对照。结果方法检测灵敏度为0.4μg·mL-1，海洛因依赖者戒毒后6～15天尿液转阴，对照组尿液均为阴性。张杰等对三种尿吗啡检测产品（胶体金试剂盒）四种规格进行比较分析。试验结果显示：四种产品间存在差异（P<0.05）或显著性差异（P<0.01），其中SurestepTM产品在有效率、显色分级判断和显色时间上均优于其它几种产品。孙岩辉等应用Visualine-Ⅱ尿液检测试剂盒对250例吸毒者进行尿液毒品测定，其中阳性247例，阳性率98.8%。Jehanli等应用GICA法与数字成象技术相结合，对大麻和可待因给药后唾