一种抗水癌的血清蛋白-木糖美拉德反应产物膜的制备及性能研究

一种抗水癌的血清蛋白-木糖美拉德反应产物膜的制备及性能研究

传统的塑料包装虽然方便，但很难分解，导致“白色”污染。因此，安全、无害、环保的原材料膜越来越受到重视。可食用膜是指通过浸渍等形式覆盖于食品表面的一层由可食性物质组成的薄层,它可阻止或减少水分和气体的迁移,并对食品起到机械保护的作用。以蛋白质为基料的可食膜在20世纪90年代以后成为可食膜研究的焦点。而蛋清蛋白作为一种来源广泛的蛋白质,富含蛋白质约40种且包含人体所必须的8种氨基酸,人体对其消化吸收率在98%之上,已经成为可食用膜的重要原料之一。但由于蛋白质的亲水性导致蛋白膜的阻水性较差,如大豆蛋白膜的阻水性较大豆蛋白-羧甲基葡甘聚糖复合膜差。因此有必要对蛋白质进行改性,蛋白质的改性主要包括物理改性、化学改性以及酶法改性等方法。而通过美拉德反应对蛋白质进行糖基化则是化学改性的一种。美拉德反应主要是指还原糖与氨基酸、蛋白质之间通过羰氨缩合生成蛋白质-糖共价化合物的反应。研究表明应用美拉德反应可以改善蛋清蛋白的凝胶性和乳化性。Matsudomi等用半乳甘露聚糖通过美拉德反应对蛋清蛋白进行改性,结果显示美拉德反应产物形成的凝胶其强度、持水性、透明性均有所提高。Kato等利用6-磷酸葡萄糖与卵白蛋白发生美拉德反应,结果显示卵白蛋白的乳化性提高了5倍。此外,美拉德反应还可以改善蛋白膜的水蒸气透过率。张曦等用木糖通过美拉德反应对乳清蛋白进行糖基化,得到的乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜同乳清蛋白相比,水蒸气透过率降低约24%。并且美拉德反应产物具有良好的抗氧化性。美拉德产物可以抑制果蔬中的多酚氧化酶,如葡萄糖/果糖-谷胱甘肽的美拉德反应产物对苹果中多酚氧化酶有抑制作用。Lee研究发现,甘氨酸-葡萄糖体系加热时,其美拉德反应产物对多酚氧化酶的抑制力随加热时间的延长而增强,也随底物浓度的增大而增强。核桃仁含有60%~70%的脂肪,其中90%是人体必需的不饱和脂肪酸。这些不饱和脂肪酸能降低人体血清中的胆固醇,防止动脉粥样硬化,利于婴儿大脑发育和幼儿心脏发育,促进皮肤发育。然而,油脂易受光、热、氧等因子影响发生脂质过氧化,从而降低其营养价值和商品价值。王若兰等的研究表明,喷涂面筋蛋白膜可以显著抑制核桃仁酸价的上升。狄建兵的研究表明大豆分离蛋白膜在一定程度上可以抑制核桃仁的脂质过氧化。周柏玲等的研究表明,玉米醇溶蛋白复合膜包衣及大豆分离蛋白膜对核桃仁的脂质过氧化都有很好的抑制效果。张曦等的研究表明,乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜可以有效地抑制核桃仁的脂质过氧化。但关于蛋清蛋白-糖美拉德反应产物膜对核桃仁的包裹国内文献还没有报道。本实验首先研究不同糖类、不同pH、不同加热温度以及不同糖浓度对蛋清蛋白-糖美拉德反应进程的影响,通过蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物在450nm处的吸光值和十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳确定反应程度,制备蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物,进一步用蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物制备膜,研究其成膜性以及水蒸气透过率。最后用蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物膜对核桃仁进行包裹,考察其对核桃仁酸价的影响。1材料和方法1.1改性乳化试剂及仪器核桃:农贸市场,去壳将核桃仁取出,选取大小均一的核桃仁包膜用(直径为2.5~3cm);蛋清蛋白(EggWhiteProtein,EWP):蛋白质含量标示为78%以上,大连绿雪蛋品发展有限公司;甘油:分析纯,北京京顺化学试剂有限公司;木糖(Xylose):木糖含量标示为98.5%,北京嘉康源科技发展有限公司。DHG-9245A型电热鼓风干燥箱:上海一恒科学仪器有限公司;水蒸气透过率测定装置:北京市智勤七翔塑料公司;Model680型酶标仪:BioRadLaboratoriesIncorporation。1.2实验方法1.2.1蛋白饮料的配制市售蛋清蛋白粉在较高温度(80、90℃)下发生凝固现象,因此在制备美拉德反应产物时首先将12g/100mL的蛋清蛋白溶液于14000×g离心40min,然后将上清液转移至干净烧杯中,加入蒸馏水稀释,使得最终蛋清蛋白浓度为6g/100mL,然后将烧杯置于4℃冰箱中作为蛋清蛋白工作液。(1)不同糖类对蛋清蛋白-糖美拉德反应的影响:分别称取木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖适量溶于蛋清蛋白工作液,使糖浓度为3g/100mL。调节pH至11,水浴锅中90℃加热30min,取出后冷却至室温,用酶标仪测定其在450nm处的吸光值,每组重复3次取平均值。(2)不同pH对蛋清蛋白-木糖美拉德反应的影响:将木糖溶于蛋清蛋白工作液,使其浓度为3g/100mL。调节pH至8、9、10、11,水浴锅中90℃加热30min,观察是否有凝固现象,对无凝固现象的组别,将其取出后冷却至室温,用酶标仪测定其在450nm处的吸光值,每组重复3次取平均值。(3)不同加热温度对蛋清蛋白-木糖美拉德反应的影响:将木糖溶于蛋清蛋白工作液,使其浓度为3g/100mL。调节pH至11,水浴锅中分别于60、70、80、90℃加热30min,取出后冷却至室温,用酶标仪测定其在450nm处的吸光值,每组重复3次取平均值。(4)不同木糖浓度对蛋清蛋白-木糖美拉德反应的影响:称取适量木糖溶于蛋清蛋白工作液,使其浓度分别为0、3、6、12g/100mL。调节pH至11,水浴锅中90℃加热30min,取出后冷却至室温,用酶标仪测定其在450nm处的吸光值,每组重复3次取平均值。1.2.2血清蛋白-木糖美拉德反应产物的分离纯化取蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,参照Jing和Kitts的方法并稍作改动:在凝胶玻璃板中先加入6.5mL15%的分离胶,室温(20℃)静置35min使其凝固,然后加入2.0mL5%的浓缩胶,室温(20℃)静置1.5h使其凝固。同时取稀释后的蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物50μL与等体积样品处理液混合后煮沸5min,取出后冷却至室温(20℃)。加样时每孔加样15μL,电泳过程中当样品经过浓缩胶时,电压为80V,经过分离胶时,电压为120V,经1.5h后溴酚蓝指示剂到达底端,电泳结束。取出胶用考马斯亮蓝-R250染色液染色12h,最后由脱色液脱色至条带清晰可见。1.2.3调节体系ph水浴锅加热按照实验设计比例(3、6g/100mL)称取适量木糖溶于蛋清蛋白工作液,调节体系pH至11,水浴锅中90℃加热30min。取出冷却至室温(20℃),按照实验设计比例加入甘油(0.7、1.0、1.3mL/100mL)混匀,然后倒入平皿(6mL),室温(20℃)条件下成膜。1.2.4wvp的测定水蒸气透过率(Watervaporpermeability,WVP)的测定采用拟杯子法:将膜密封于装有5g无水氯化钙(相对湿度0%)的自制有机玻璃透湿杯(杯口直径为50mm)封口处,置于装有饱和KBr溶液(相对湿度为80%)的密封干燥器内。在室温条件下测定每个有机玻璃透湿杯在4h内每隔40min的质量增加量,记录7次测定的结果,用来表示经过膜进入测定装置的水蒸气质量。WVP计算公式为:式中:Δm为一定时间内WVP测定装置的质量增加量,g;d为膜厚度,mm;ΔP为膜两侧的水蒸气压差,kPa。本实验中,膜有效测定面积A值为0.00196m2,ΔP值为1.9377kPa。1.2.5核桃仁的制备制备最佳条件下和蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物成膜溶液200mL(蛋清蛋白浓度6g/100mL,木糖浓度3g/100mL,甘油浓度1.0mL/100mL,pH11,90℃加热30min),蛋清蛋白成膜溶液作为对照(蛋清蛋白浓度6g/100mL,甘油浓度1.6mL/100mL,pH8,40℃加热30min)。经过加热的成膜溶液冷却至室温(20℃),挑选预先剥好的大小均一的核桃仁(直径约2.5cm)浸入到成膜液中(每组150g,共4组),用玻璃棒轻轻搅拌5min,保证所有核桃仁被成膜溶液均匀包裹。将浸泡后的核桃仁置于铁笊篱上沥干溶液,铺于硫酸纸上,在自然条件下晾干(约12h)。实验前1d将盛有饱和KBr(相对湿度80%)的干燥器放入温度为50℃或37℃的烘箱中进行平衡。第1组核桃仁装在干净烧杯中,将烧杯置于实验室里干净的抽屉中,将第2组、第3组以及第4组核桃仁置于平衡好后的干燥器中。每隔相同时间取出30g核桃仁,在研钵中磨碎成糜状,在150mL石油醚中浸泡12h,2800×g离心10min。取上清液在40℃条件下真空旋转蒸发,得到核桃仁油脂备用。1.2.6核桃油脂的加标实验根据GB/T5530—2005所提供的方法测定酸价:在50mL乙醇和乙醚(体积比为1:1)中加入3g核桃油脂。以酚酞为指示剂,用0.1mol/LKOH滴定至溶液呈浅粉色,记录所消耗体积。根据下述公式计算酸价:式中:CKOH为KOH的摩尔浓度,mol/L;1.2.7分析过程学术研究数据的显著性差异由Minitab软件(MinitabInc.,PA,USA)进行分析。对数据进行单因素方差分析(Onewayanalysisofvariance,onewayANOVA),以Tukey多重比较进行检验,得到各组数据间的显著性差异(p<0.05)。2结果与讨论2.1不同的麦芽糖与氨基酸不同的糖同蛋清蛋白在90℃进行加热,其反应产物的吸光值为木糖>果糖>葡萄糖>蔗糖(图1)。这与吴慧玲等人用不同的糖类同赖氨酸进行美拉德反应时得出的木糖反应最快而蔗糖没有显示反应活性的结论是一致的。此外,王莹在用不同糖类同谷氨酸进行美拉德反应时也得出结论D-木糖与谷氨酸反应得到的美拉德反应产物颜色最深。因此,最终选择木糖作为同蛋清蛋白进行美拉德反应的糖。2.2ph11的变化不同的pH对蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物有显著性影响,在pH8、9时蛋清蛋白-木糖体系在90℃加热发生凝固,而在pH10、11时无凝固现象发生,并且蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物的吸光值随着pH的增加而显著增大(图2)。即反应速率显著提高,因此最终选择pH11为蛋清蛋白-木糖美拉德反应的最终pH。蛋清蛋白-木糖用蒸馏水配制成溶液,其pH是6.8。在pH10时,蛋清蛋白与木糖发生反应,原有条带开始变浅,但没有明显的新的条带的出现。pH11时,蛋清蛋白原有条带变浅并且在浓缩胶顶端可以看到有高聚物生成,证明了蛋清蛋白与木糖发生了美拉德反应,并且生成了大分子的物质(图3)。不同糖类之间进行比较,蛋清蛋白与木糖交联程度最大。蛋清蛋白同果糖进行反应时,原有条带开始变浅,浓缩胶顶端也有高聚物的生成,但其带的颜色较蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物的颜色浅。蛋清蛋白同葡萄糖进行反应时,蛋清蛋白原有条带变浅,在浓缩胶顶端有浅色的高聚物的条带出现。蛋清蛋白与蔗糖进行反应,原有蛋清蛋白条带没有发生明显变化,结合之前的吸光值变化,说明不同糖类同蛋清蛋白的反应活性顺序为木糖>果糖>葡萄糖。而蔗糖没有表现出反应活性(图3)。2.3血清蛋白-木糖的制备随着加热温度的升高,蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物的吸光值显著增大。经60℃加热30min的蛋清蛋白-木糖体系的吸光值与未加热时无显著性差异。而在90℃加热30min,蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物的吸光值已经达到1.50,反应速率最快。因此最终选择90℃加热30min为加热条件(图4)。2.4克氏原螯虾血清蛋白-木糖美拉德反应产物的吸光值木糖浓度为6g/100mL的蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物的吸光值显著大于木糖浓度为3g/100mL的蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物的吸光值,而与木糖浓度为12g/100mL的蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物的吸光值在整个加热过程中都没有显著性差异(图5)。2.5血清蛋白-木糖美德反应产物膜的水提取物含量2.5.1膜厚度和地震反应产物的透气性能在甘油浓度为1%时,不加木糖的蛋清蛋白不能形成完整的膜,故无法测定膜厚度和水蒸气透过率。而加入木糖的蛋清蛋白通过和木糖间的美拉德反应可以形成完整的黄色透明的膜。木糖浓度6g/100mL的蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物膜的膜厚度和水蒸气透过率都显著大于木糖浓度为3g/100mL的蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物膜(表1)。据报道,乳清蛋白膜与普鲁兰糖共同成膜时,水蒸气透过率随着糖质量浓度的增高而增高,张曦等人在制备乳清蛋白-木糖美拉德反应产物膜时,水蒸气透过率也随着木糖浓度的增高而增高,这可能是由于木糖中含有一定数量的-OH,使其亲水性有所提高,从而降低了膜对水蒸气的阻隔。另一方面,木糖浓度的增加会增加膜的厚度这也是导致其水蒸气透过率增加的一个原因。为了保证膜较好的阻湿性能,因此最终选择木糖浓度为3g/100mL。2.5.2甘油浓度对乳清蛋白膜透气性能的影响随着甘油浓度的增高,蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物膜厚度和水蒸气透过率增高(表2)。Gennadios等的研究结果也表明,甘油浓度的增高会降低蛋清蛋白膜的水蒸气透过率,而McHugh等的研究结果也表明增塑剂的加入会增大乳清蛋白膜水蒸气透过率,该结果与溶液孔径随甘油浓度的增高而增加有关,也与成膜的厚度有一定关系。综合考虑最终选择的蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物膜的甘油浓度为1.0mL/100mL。2.6膜包裹对核桃仁酸价的影响贮藏条件为50℃加热8d,贮藏过程中各组核桃仁的酸价均一直上升,且在第8天达到最大。贮藏8d后,第2组经过加热的未包膜的核桃仁酸价上升最多,经蛋清蛋白包和蛋清蛋白-木糖美拉德反应产物膜包裹的核桃仁酸价比第2组降低15%,但经过膜包裹的2组核桃仁的酸价之间无