基因工程第一章概述

基

因

工

程赵晓梅课程介绍：理论课32课时，实验32课时，共计64课时。教材：张惠展,贾林芝.北京：高等教育出版社,2010基因工程5

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概述DNA重组克隆的单元操作大肠杆菌基因工程酵母基因工程高等动物基因工程高等植物基因工程实验32课时实验一：实验二：实验三：实验四：实验五：考核总成绩=主卷成绩+副卷成绩+平时成绩主卷成绩=期末成绩（闭卷）（40%）副卷成绩=实验报告+考勤（30%）平时成绩=小考+论文作业+考勤（30%）主卷题型：名词解释、填空、选择、判断及简答等参考资料：1.《基因操作原理》，SandyBPrimrose,RichardTwyman,BobOld，（第六版）（影印版）PrinciplesofGeneManipulation,6thed.高等教育出版社，2002年2.《基因克隆和DNA分析》，T.A.Brown，（第四版）（影印版）GeneCloningandDNAAnalysis:AnIntroduction,4thed.高等教育出版社，2001年3.《遗传工程导论》，（DesmondS.T.Nicholl，第二版）（影印版）AnIntroductiontoGeneticEngineering，2nded，高等教育出版社，2004年4.基因VIII5.《基因操作原理》，SandyBPrimrose,RichardTwyman,BobOld著瞿礼嘉顾红雅译（第六版）（中文版）高等教育出版社，2004年。6.刘祥林，聂刘旺.基因工程.北京：科学出版社，20057.何水林.基因工程.北京：科学出版社，2008有关基因工程的主要刊物中国生物化学与分子生物学报；植物生理与分子生物学学报；生物化学与生物物理学报；遗传学报；科学通报；中国科学；国外生物学（遗传学分册，分子生物学分册等）。《Science》；《Nature》；《Gene》；《J.Mol.Biol》；《LifeScience》andsoon.基因工程主要网站：生物网址通http://www.bio-address.com/基因通http://www.genetong.com/中国生物工程网http://www.cnbiotech.com/人体基因数据库http://gdbWWW.gdb.org中国生物技术信息网http://www.biotech./生物技术网http://biology.aweb.com.cn/第一章

概述InsectinfestationonBt(right)andnon-Bt(left)cottonbolls/programs/lifesciences/TransgenicCrops/images/cotton.jpgWild-typecornshowinginfestation-BtcornisresistanttothisPotatoesareoneofmanyplantsbeingusedtoproducevaccines/sept_issue/images/breakthrough/veggievaccine.jpg嗯？！真的？预防传染病！还不快吃愣什么！一．基因工程的基本概念基因（gene）：从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype），可以由于突变生成等位基因变异体（体细胞父源和母源；正常和突变基因）；从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。A狭义的基因工程（一）基因工程的基本概念Geneengineering/Genecloning/Molecularcloning/又称为RecombinantDNAtechnology，重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行剪接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。因为通过人工设计，得到一定的设计方案，故称为基因工程。由于整个操作在分子水平上进行，所以也称分子克隆。B广义的基因工程（一）基因工程的基本概念

基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术/狭义的基因工程）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。切接转检增(二)基因工程的基本过程

（1）从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开（简称切）；（2）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子（简称接）；（3）借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中（简称转）；（4）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简称增）；（5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞（简称检）。基因工程的上游操作过程可简化为：切、接、转、增、检。(三)基因工程的基本原理提高外源基因的剂量——分子遗传学原理筛选、修饰、重组基因表达的转录调控元件，如：启动子、增强子、操作子、终止子、上游调控序列等——分子生物学原理修饰、构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：SD序列、mRNA非编码区、密码子等——分子生物学原理基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产——生化工程学原理(四）基因工程在生物工程中的地位

生物技术，有时也称生物工程，是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产所需产品或达到某种目的。因此，生物技术是一门新兴的，综合性的学科。先进的生物技术手段是指基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程革新技术。改造生物体是指获得优良品质的动物、植物或微生物品系。生物原料是生物体的某一部分或生物生长过程所能利用的物质，如淀粉、糖蜜、纤维素等有机物，也包括一些无机化学品，甚至某些矿石。(四）基因工程在生物工程中的地位

生物技术主要包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程五项技术。细胞工程是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养反之，或人为使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动植物个体，或获得某种有用的物质的过程。所以细胞工程应包括动植物细胞的体外培养技术，细胞融合技术，单克隆抗体，核移植，胚胎移植技术等。(四）基因工程在生物工程中的地位

发酵工程：利用微生物生长速度快，生长条件简单以及新陈代谢过程特殊等特点，在合适条件下，通过现代工程技术手段，由微生物的某种特定功能生产出人类所需的产品称为发酵工程，有时也称微生物工程。

(四）基因工程在生物工程中的地位

酶工程是利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能，借助生物反应装置和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术，包括酶的固定化技术、细胞的固定化技术、酶的修饰改造化技术及酶反应的设计等技术。

(四）基因工程在生物工程中的地位蛋白质工程是指在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学、计算机辅助设计和蛋白质学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰、改造、拼接以产生能满足人类需要的新型蛋白质。

基因工程的基本形式(四）基因工程在生物工程中的地位第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程

第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程二、基因工程诞生前的理论和技术的准备（一）基因工程诞生的理论基础（二）基因工程诞生的技术突破（一）基因工程诞生的理论基础GregorMendel于1865年在“布隆自然历史学会”上宣读了他的《植物杂交实验》论文，并于1866年发表于该会的会议录上。

（1822-1884）35年之后，即1900年才被荷兰的H．DeVries、德国的C．Correns和奥地利E．Tschermak等植物学家重新发现。1、遗传因子

1909,丹麦W.Johannsen(约翰逊)为了强调“遗传因子”与生命的关系,他根据希腊“给予生命”之义的词“gene”（基因）创造性地用“gene”这个术语来代替“遗传因子”。---基因术语的提出1857～1927

（1866～1945）

1910,美国T．H．Morgan(摩尔根)创立了遗传的染色体理论

基因与DNA尽管由于Morgan等人的出色工作，使基因学说得到了普遍的承认，但直到1953年Watson-CrickDNA模型提出之前，人们并不理解：a.基因的物质内容和结构特征；b.位于细胞核中的基因如何控制发生在细胞质中的生化过程；c.在细胞分裂过程中，为何基因可准确地复制自己。2、DNA是遗传物质

a、肺炎双球菌转化实验1944年Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。超越时代的科学成就往往不易被人们接受，Avery当时并未赢得阵阵掌声，他的论文事隔10年以后才公开发表。

b、噬菌体转染实验

1952年AlfredHershy和MarshaChase进一步证明遗传物质是DNA。DNA是遗传物质

a、肺炎双球菌转化实验b、噬菌体转染实验1944年Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。1952年AlfredHershy和MarshaChase进一步证明遗传物质是DNA。3、1953年J.watson和F.Crick根据碱基配对规律和DNA分子的X射线衍射图谱等实验，提出了DNA分子的双螺旋结构。

1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。

4、中心法则和遗传密码

20世纪60年代，确定了遗传信息的传递方式：DNA→RNA→Pr，破译了全部遗传密码，43。

1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”DNARNAProtein1964年MarshallNirenberg和GobindKhorana等终于破译了64个遗传密码（二）基因工程诞生的技术突破1.限制性内切酶（“基因剪刀”）－基因工程技术诞生的第一个技术准备

（1）20世纪40－60年代，科学家们就为基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大的dsDNA（104，2.2*1011公里）束手无策，无从下手把它切成单个基因片断。（2）当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命。（3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌（Haemophilusinffuenzae）分离纯化了HindⅡ，取得了突破，打破了基因工程的禁锢，迎来了改造生物的春天，为基因工程奠定了最为重要的技术基础。1、限制性内切酶（restrictionenzymes）

1978年Nobel生理或医学奖

细菌限制修饰系统的发现WernerArber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。H.O.Smith和Wilox于1970年首次从流感嗜血杆菌（H.influenzae）中发现并分离HindII限制酶。H.O.SmithSV40限制图谱和转录图谱的绘制D.Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。2、DNA连接酶（ligase）1967年发现了DNA连接酶，可参与DNA裂口的修复，1970年发现T4连接酶，具有更高的链接活性。3、载体（vector）

1972年前后使用小分子量的细菌质粒和

噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。

(5).琼脂糖凝胶电泳载体(“交通工具车子”)－基因工程技术诞生的第二个技术准备

（1）

有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得有一个车子将重组DNA送到宿主细胞中去。（2）1946年起，Lederberg就研究细菌性因子（F因子），50-60年代相继发现了R因子（抗药因子），CoE(大肠杆菌因子)等质粒。（3）然而，直到1972年Cohen才能将质粒作为基因工程载体使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。这是基因工程的第二个技术准备。

4．逆转录酶－1970年Baltimove和Temin等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。(1)真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。HGP2005年完成，2.8万个基因，1－3kb/基因，2.2*1011公里。（2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的mRNA就不能得到相应得产物。（3）经过逆转录mRNA→cDNA(complementoryDNA)文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。有了这些理论核技术的武装，基因工程的临盆降生指日可待，Berg和Cohen两位科学的“助产士”，把基因工程接到了人间。

5、感受态体系1970年M.Mandel和A.Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S.Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。6、琼脂糖凝胶电泳

1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。7、DNA测序技术1975年F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert发明了DNA快速测序技术。三、基因工程理论依据1.基因有共同的物质基础：

有遗传功能的特定核酸序列：DNA片段或RNA。2.基因可切割：

存在间隔序列（重叠序列的基因也可切出）。3.基因可转移：可在染色体DNA或不同染色体之间跳跃，基因组也可重组。四、基因工程的历史

本课程的地位：现代科技革命高新技术生物技术基因工程基因克隆(一)基因工程的诞生（1）PaulBerg的开创性实验

1972年斯坦福大学的PaulBerg小组完成了首次体外重组实验：将SV40的DNA片断与

噬菌体的DNA片断连接起来。1980年Nobel化学奖

（2）Boyer-Cohen实验

1973年斯坦福大学的S.Cohen小组：将携带链霉素抗性基因的大肠杆菌质粒与携带四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。标志着以DNA重组技术为核心的基因工程的诞生。PscloltetrRb-3nersrtetrner

tetr

nerOtetrneCohenGroup第一次实现了细菌遗传性状转移示意图(二)基因工程的成熟早在基因工程发展的初期，人们就已开始探讨将该技术应用于大规模生产与人类健康水平密切相关的生物大分子，这些物质在人体内含量极小，但却具有非常重要的生理功能。1977年，日本的Tfahura及其同事首次在大肠杆菌中克隆并表达了人的生长激素释放抑制素基因。1977年，美国的Ullvich随即克隆表达了人的胰岛素基因。1978年，美国Genentech公司开发出利用重组大肠杆菌合成人胰岛素的先进生产工艺，从而揭开了基因工程产业化的序幕主要基因工程产品的研制开发生产简况列在表1-1中。除此之外，最近十年来又有数以百计的新型基因工程药物问世，另有400余种药物正处于研制开发中。DNA重组技术已逐渐取代经典的微生物诱变育种程序，大大推进了微生物种群的非自然有益进化的进程.表1-1主要基因工程产品的研制、开发、上市时间产品时间国家用途上市时间国家人生长激素释放抑制素(SRM)1977日本巨人症人胰岛素1978美国糖尿病1982欧洲人生长激素（HGH）1979美国侏儒症1985美国人α-干扰素（IFN）1980美国病毒1985欧洲乙肝疫苗（HBsAgV）1983美国乙肝1986欧洲人白细胞介素1984美国肿瘤1989欧洲人促红细胞生成素（EPO）日本贫血1988欧洲人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美国人组织纤溶酶原激活剂（t-PA）血栓症1987美国(三)基因工程的腾飞八十年代以来，基因工程已开始朝着高等动植物物种的遗传特征改良以及人体基因治疗等方向发展。1982年，美国科学家将大鼠的生长激素基因转入小鼠体内，培育出具有大鼠雄健体魄的转基因小鼠及其子代。1983年，携带有细菌新霉素抗性基因的重组Ti质粒转化植物细胞获得成功，高等植物转基因技术问世。1990年美国政府首次批准一项人体基治疗临床研究计划，对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷而患有重度联合免疫缺陷症的儿童进行基因治疗获得成功，从而开创了分子医学的新纪元。1991年，美国倡导在全球范围内实施雄心勃勃的人类基因组计划，用15年时间斥资30亿美元，完成30亿对碱基的全部测序工作。目前这项计划已经提前完成,并迅速进入后基因时代.1997年，英国科学家利用体细胞克隆技术复制出“多利”绵羊。2008年,美国和日本借助转基因技术实现了分化终端的细胞向干细胞的转化。转移大鼠生长素基因的小鼠五、基因工程的研究意义分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种基因工程可以绕过远缘有性杂交的困难，使基因在微生物、植物、动物之间交流，迅速并定向的获得人类需要的新的生物类型。大规模生产生物活性物质工程细胞基因工程蛋白质工程途径工程发酵工程细胞工程分离工程酶酶工程分离工程天然细胞天然细胞生物活性物质六、基因工程的应用（一）基因工程在农业生产中的应用1、利用基因工程技术改良作物品质2、利用基因工程技术培育抗虫作物

3、利用基因工程技术培育抗病作物

4、利用基因工程技术培育抗逆性强的作物

5、利用基因工程技术培育抗除草剂作物

6、生物固氮7、

利用基因工程调控植物激素和生长发育

转基因动物基因工程在工业中的应用基因工程在医药上的应用基因工程在环境保护中的应用……基因本身也是一个产业Rockfeller大学将人肥胖基因出售0.2亿美元Amgen公司将FKBP神经免疫因子配体转让达3.29亿美元Millennium公司以4.65亿美元向Bayer公司转让225种基因的开发权基因工程试剂的高回报碱性成纤维细胞生长因子231元/ug红细胞生成素1072元/ug白细胞介素-2410元/ug巨细胞粒细胞集落刺激因子1960元/ug胰岛素10.2元/mg小结A重组DNA技术的理论基础19世纪中孟德尔豌豆杂交试验遗传因子经典遗传学20世纪初摩尔根果蝇杂交实验基因基因学1944年艾弗瑞肺炎双球菌转化实验遗传物质DNA1973年伯格-杰克森-考恩-鲍耶DNA分子体外拼接分子遗传学1953年沃森-克瑞克DNA双螺旋结构分子生物学基因工程基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。（通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。）第二章DNA重组克隆的单元操作赵晓梅切接转检增完整的基因克隆过程

基因工程的基本条件

C用于基因转移的受体菌或细胞

A用于基因克隆的载体B用于核酸操作的工具酶Vector：是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。第一节载体（Vectors）克隆载体:克隆基因表达载体:表达基因整合载体:通过载体把基因整合到基因组上载体的功能及特征载体的功能为外源基因提供进入受体细胞的转移能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供在受体细胞中的扩增或表达能力载体的功能及特征载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）

具有合适的筛选标记

具有较高的外源DNA的载装能力具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点基因工程对宿主细胞的要求宿主细胞是基因克隆中重组DNA分子的繁殖场所，适当的宿主细胞，必须符以下条件：载体的复制和扩增没有严格的限制；不存在特异的内切酶体系降解外源DNA；在重组DNA增殖过程中，不会对它进行修饰；重组缺陷型，不会产生体内重组；容易导入重组DNA分子；符合重组DNA操作的安全标准。基因工程中常用的载体有5类：克隆载体的种类1)质粒（plasmid）2)单链DNA噬菌体M133)噬菌体的衍生物4)柯斯质粒（cosmid）5)动物病毒（virus）一、质粒（plasmid）Plasmid：是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子即cccDNA，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。质粒DNA的分子量范围：1-100kb质粒的生物学特性1、质粒DNA的构型：

SC型共价闭合环形DNA（cccDNA）

OC型开环DNA（ocDNA）

L型线性DNA（cDNA）

2、不同质粒的分子量大小差异相当显著：106~108D3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分：复制基因（replicator）、选择性记号、克隆位点

LOCSC多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker克隆载体多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker克隆载体（一）质粒的基本特征

1、质粒的自主复制性（一）质粒的基本特征2、可扩增性质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系，根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制1-3拷贝stringentplasmid

松弛型复制30-50拷贝relaxedplasmid（一）质粒的基本特征3、可转移性

革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：

接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等。非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员。值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程依赖于mob基因产物与其他蛋白因子的相互作用。（一）质粒的基本特征4、质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容质粒的不相容性：分子机制

两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。（一）质粒的基本特征

5、携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义（二）质粒的改造与构建天然存在的野生型质粒的局限性：分子量大、拷贝数低单一酶切位点少遗传标记不理想等缺陷不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。质粒的改造与构建的指导思想：尽量缩小相对分子质量（３∽１０kb）；灭活某些质粒的编码基因，如mob基因；具有适当的多克隆位点以便外源DNA插入；具有插入失活筛选标志，便于从平板上直接筛选阳性重组子；根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件或用于表达产物亲和层析分离的标签编码序列。作为载体的质粒一般具有以下特点：分子相对较小（３∽１０kb）；具有适当的多克隆位点以便外源DNA插入；具有插入失活筛选标志，便于从平板上直接筛选阳性重组子；质粒能携带的外源DNA片段一般较小（<15kb）pBR322

p：代表质粒

BR：代表研究质粒的研究者(Bolivar&Rogigerus)

322：与科学家有关的数字

含有两个抗生素抗性基因AmpR、TetR

单一的BamHI、SalI的识别点都在TetR基因内,

单一的PstI识别位点在Amp抗性基因内

pBR322带有一个复制起始位点,保证质粒只在大肠杆菌进行复制。（1）元件来源pSF2124质粒的AmpR基因（1）元件来源①复制起点oripMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点②AmpR基因③TetR基因pSC101的TetR基因。（2）长度4363bp（3）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。（4）克隆位点其中9个会导致TetR基因失活（如

BamHI、HindⅢ、SalI）；3个会导致AmpR基因失活（ScaI、

PvuI、PstI）。24个克隆位点。（5）pBR322的优点①双抗菌素抗性选择标记插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞

在Amp或Tet中都死亡。获得携带外源基因载体的寄主细胞

在Amp或Tet其中之一中死亡。获得未携带外源基因载体的寄主细胞

在Amp或Tet中都生存。AnnealingofComplementary“Sticky”EndsAmpRtetRAmpRtetS插入DNA片段DNAligasepBR322重组体选择方法插入DNA片段外源基因

BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因

PstITet中存活但在Amp中死亡外源基因抗Amp抗Tet抗Amp抗Amp抗Tet抗Tet重组DNA空载体不含有载体或重组DNA氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy④安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。③高拷贝数②分子小，克隆能力大载体越小越好。>10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。AnnealingofComplementary“Sticky”Ends质粒载体pUC19

pUC系列UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19pUC18/19pUC质粒系列

pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成的。它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，含LacZ基因的启动子及编码α-肽链的DNA序列（lacZ’），位于lacZ’基因中的靠近5’端的MCS，但不破坏该基因的功能。

①复制起点:pBR322的ori但其上失去了克隆位点。②Ampr基因:（1）元件来源③lacZ的启动子:大肠杆菌④lacZ’基因大肠杆菌lacZ的

-肽链序列，是LacZ的氨基端片断。pBR322的Ampr基因（2）长度约2.7kb（3）克隆位点10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。pUC18/19Ampicillin抗性和lacZ的

肽互补(蓝白斑）相结合。（4）选择标记蓝白斑选择原理：①Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-

-D-galactoside即5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷）

-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝

-半乳糖苷酶②

-半乳糖苷酶Xgal显色反应：IPTG的诱导作用IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和载体的lacZ’

肽都表达。从而互补。但载体MCS上插入外源DNA后，不能产生

肽！IPTGX-gal5-bromo-4-chloro-3-indolylβ－D-galactopyranosideGalactosebluedyeβ-galactosidase筛选方法:蓝-白筛选通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。MCS无插入时，互补，蓝菌斑。MCS有插入时，不互补，白菌斑。IPTG诱导的结果：AnnealingofComplementary“Sticky”EndsCutvectorandforeignDNATransformationPlateonampicillin,x-galandIPTGmediumBlueWhitepUC19VectorLacpromoterInsert

pUC19重组体选择方法诱导物

ZYX

PO

ZYX

PO乳糖标志补救（ß-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段lacZX-galLacZ蓝色化合物X-gal（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶（5）pUC系列载体的优点①更小的分子量：如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。②选择方便Xgal显色、抗菌素双重直接选择。③克隆便利具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。④测序方便其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。穿梭质粒载体（1）穿梭质粒载体的结构人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。（shuttleplasmidvectors）MCS大肠杆菌

枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌

酿酒酵母穿梭载体大肠杆菌

动物细胞穿梭载体（2）常用的穿梭质粒载体E.coli复制起点Yeast复制起点Yeast选择标记E.coli选择标记（3）穿梭载体的优点②也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。③可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。克隆、构建表达E.coliAnimalcell①利用大肠杆菌进行基因克隆、表达T载体

MCSTvector的克隆过程——简便！AATTTvectorPCRproductT4DNAligaseAATT

T-vector两条链的3’端含有一个游离的T

PCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个A人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：克隆质粒常用于克隆和扩增外源基因测序质粒含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒装有整合酶编码基因及整合特异性的位点序列便于外源基因的整合穿梭质粒装有针对两种不同受体的复制子便于基因克隆探针质粒装有报告基因便于启动子等元件的克隆筛选表达质粒装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件（三）质粒的分类（四）质粒DNA的分离纯化

氯化铯密度梯度离心法质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染沸水浴法质粒DNA纯度底、快速、操作简便碱溶法质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间实验原理

在pH12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质粒DNA虽然H键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。当在溶液体系中加入pH4.8的KAC时，溶液恢复中性，质粒DNA迅速复性，染色体DNA则由于变性而相互混乱缠绕，不能复性，从而离心即可以把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。碱溶法实验材料、器具及药品

实验器具

微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器。实验材料含某种质粒载体的E.coliDH5α菌株，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心管架。

实验药品1.LB培养基配制及分装(每升用量)胰蛋白胨(Bacto-tryptone)10g酵母提取物(Bacto-yeastextract)5gNaCl10gpH7.5121℃，20min高压灭菌

2.溶液溶液Ⅰ

200ml50mmol/L葡萄糖1.98g25mmol/LTris-Cl(pH8.0)5ml1M10mmol/LEDTA(pH8.0)5ml0.4M溶液Ⅱ0.4mol/LNaOH2%SDS临用前1:1混合贮存液即为II液.溶液Ⅲ5mol/L醋酸钾60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml(最终pH4.8)3.分离液酚/氯仿/异戊醇＝25:24:14.无水乙醇5.70%乙醇6.TE缓冲液(pH8.0)Tris-HCl10mmol/LEDTA-Na25mmol/L实验步骤

接种含某质粒的大肠杆菌到1.5ml含有60μg/mlAmp抗生素的LB液体培养基

37℃摇培过夜（10~12h）

12000rpm,3min弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。加100μlⅠ液，涡旋震荡，充分混匀配制适量的Ⅱ液加200μlⅡ液，迅速轻轻混匀（以颠倒EP管5-10次为宜），冰浴，5-10min，此时应有丝状物出现。加150μlⅢ液，轻轻混匀，冰浴，5min以上此时应有絮状物出现。↓12000rpm,5min取上清液，加等体积的酚-氯仿-异戊醇，涡旋振荡，使溶液呈现乳白色，5min↓12000rpm,10min取上清液，加2倍体积的冷乙醇，混匀，-20℃，30min↓12000rpm,10min弃去上清液，用70%乙醇清洗沉淀↓干燥加20μlTE溶解，4℃保存凝胶电泳和分光光度检测cccDNAL-DNAocDNA氯化铯密度梯度离心法：

用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs沸水浴法：

1、用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体2、加溶菌酶裂解细菌细胞壁3、沸水浴40秒钟4、离心，用无菌牙签挑去沉淀物5、乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA二噬菌体噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）。（一）噬菌体的一般特性结构：蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等）。分为两种：1.溶菌周期：（二）噬菌体的生活周期感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。烈性噬菌体（virulentphage)2.溶原周期：感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化（lysogenization)。整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。温和噬菌体（temperatephage)原噬菌体（prophage)：（三）

Lambdaphagegenomeλ噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体，由外壳蛋白和双链线状DNA组成AWBCDEFZUVGHMLKIJb2

cIcrocIIOPQSR

attintxisgamredcIII

NCOS

COS头部基因尾部基因功能不明区溶源化重组早期控制阻遏DNA合成溶菌生长非必须区段注：cI基因：溶源过程控制基因λ噬菌体的基因组结构λ噬菌体基因大致分为4个区：结构区、重组区、

调控区、裂解区DNAProteincoatcoscosNonessential

regionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)λphage12bp左侧区包括使噬菌体DNA成为一个成熟的、有外壳的病毒颗粒所需的全部基因。右侧区内包含所有的调控因子、与DNA复制及裂解宿主菌有关的基因。中间区域这一段DNA可以被外源置换而不会影响噬菌体λ裂解生长的能力。置换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。

AnnealingofComplementary“Sticky”Ends

cosHeadTailReplaceableregionreplicationlyticcos（三）

Lambdaphagegenome

染色体48.5kb

其中19.4Kb是整合/切割区域；

5’两端各有12bp的互补单链序列，是天然的粘性末端，称为COS位点。

可携带15-20kb大小的外源DNA片段。

38Kb<recombinantvector<52Kbλ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达106~108/μgDNA，而以转染（translation）的方式导入的频率仅为103~105/μgDNA。

（四）体外包装λ噬菌体DNA的包装限制问题

λ噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的。上限不得超过其正常野生型DNA总量的5％左右，而低限又不得少于正常野生型DNA总量的75％。

λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5kb）的75%~105%。按野生型λDNA分子长度为48kb计算，λ噬菌体的包装上限是51kb。编码必要基因的DNA区段占28kb，因此λ载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kb。

插入型载体:只有一个限制性内切酶位点或一组多克隆位点可供外源基因插入。允许插入5-7kb的外源DNA,适于构建cDNA文库如λgt,λZAPvector。置换型载体：有两个酶切位点或两组排列相反的多克隆位点，其间的DNA片段可被外源DNA置换。适于克隆5-20kb的外源基因片段，常用于构建基因组DNA文库。（五）Phagevector的类型：

野生型噬菌体λDNA全长约50kb，上有65种限制酶酶切点，除ApaⅠ、NaeⅠ、NarⅠ、NheⅠ、SnaBⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等7种限制酶各有一个切点外，其余都多于2个。有些酶切点在增殖所必需的基因区域内。因此，噬菌体λ必须经过改造才能用作载体。现在用的λ载体大都除去了某种限制酶的酶切点。因此，作为载体的噬菌体λ都短于野生型。

(六)

噬菌体载体的构建1、构建原理：（1）删除

噬菌体的非必需区，留出插入空间。（2）删除多余限制位点

（3）灭活某些与裂解周期有关的基因，避免生物污染。（4）引入合适的筛选标记基因，便于重组噬菌体的检测。1、构建原理：(五)

噬菌体载体的构建2、构建过程①在这个非必须区内制造限制酶切点②引进某些突变表型，作为选择标记③突变某些基因，使它成为安全载体如灭活某些与裂解周期有关的基因④删除

DNA必须区段上常用的限制酶切点

噬菌体DNA上本身有5个EcoRI和7个HindIII切点！3、人工构建的

噬菌体载体有两种类型：①插入型载体（insertionvectors)：如

gt10、

gt11、

BV2、

NM540、

NM1590、

NM6071）免疫功能失活型：插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（cI基因）内。EcoRIcI

gt10插入导致载体不能合成阻遏物，

载体DNA不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。没有外源DNA插入的

载体感染受体菌形成混浊噬菌斑。选择标记:如

NM1149载体的两个克隆位点（EcoRI和HindIII）都是位于cI基因内部。2）

-半乳糖苷酶失活型载体：在

基因组中引入了LacZ’序列。（其上含有一个EcoRI克隆位点）。感染LacZ突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，利用Xgal的显色反应作选择标记。LacZ’EcoRICharon16A选择标记:②替换型载体（substitutionvectors)两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于

DNA的非必须区两端。用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源DNA片断置换。可置换区MCSMCS如：

EMBL4、Charon40等。可取代片断中如果包含LacZ’，可用Xgal显色作筛选标记。4、

载体的筛选标记②插入型载体根据插入所引起的表型突变。①置换型载体AnnealingofComplementary“Sticky”EndsλPhagecloningvector

1978年由collins和hohn改建的一种新型大肠杆菌克隆载体，用正常的质粒与噬菌体λ的cos位点构成。“cosmld”一词是由英文“cossite-carryingplasmid”缩写而成的，其原意是指带有粘性末端位点（cos）的质粒。三、CosmidCosmid:是指含有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒，由λDNA的COS区(约20-数百bp)与质粒重组而成。三、Cosmid含有抗药性标记和质粒复制起始位点一个或多个单一限制酶切位点；cohesiveend；分子小（4-6kb）,可容纳大到40-50kb的外源DNA片段，因此适于构建真核生物基因组DNA文库。选择方法：抗生素抗性筛选

Cosmid的结构特点：柯斯载体的特点：1、具有λ噬菌体的特性。柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。2、具有质粒载体的持性。柯斯质粒载体具有质粒复制子，因此在寄主细胞内能够像质粒DNA一样进行复制，并且在氯霉素作用下，同样也会获得进一步的扩增。此外，柯斯质粒载体通常也都具有抗菌素抗性基因，可供作重组体分子表型选择标记。3、具有高容量的克隆能力。柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点，一两个选择记号和COS位点等三个组成部分，其分子量较小，一般只有5～7kb左右。因此，柯斯质粒载体的克隆极限可达45kb左右。4、具有与同源序列的质粒进行重组的能力。一旦柯斯质粒与一种带有同源序列的质粒共存在同一个寄主细胞当中时，它们之间便会形成共合体。Formationofacosmidclone1.Digestion2.Ligation3.PackagingandinfectAnnealingofComplementary“Sticky”Ends四、YAC(YeastartificialChromosome)Centromere（着丝粒）CENAutonomouslyreplicatingsequence（自主复制序列）ARSARS：最初指那些酵母自主转化效率大大提高的DNA序列；这些序列在酵母中也是染色体上的复制起始位点。Telomere（端粒）TEL它可携带长达200-1000kb的DNA片段，

用YAC克隆DNA的过程与λphage相似将DNA大片段与载体的两臂相联，然后将连接混合物转化进酵母细胞中，选择方法:Ampicillin,TRP1andURA3YAC的特点:AnnealingofComplementary“Sticky”Ends质粒*受体细胞结构插入片断举例E.coli环状〈8*pUC18/19,T-载体pGEM-3z等λ噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系列，Λgt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状〈10kbM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli环状≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli环状100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳类细胞线性染色体〉1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒载体的种类和特征用于基因克隆的载体质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征单链噬菌体载体M13最常用的单链噬菌体载体是M13和它的改建噬菌体。M13是丝状噬菌体，有长约6500个核苷酸的闭环DNA基因组。M13附着在大肠杆菌的F性菌毛上，所以它们只能感染雄性细菌，即F’或Hfr细菌。当噬菌体进入细菌细胞后，单链的噬菌体DNA转变成双链复制型（RF）。从细胞中分离的RF可用作克隆双链DNA的载体。当每个细菌细胞里积聚了200到300份RF型拷贝时，M13开始不对称的合成，即只大量合成DNA双链中的一条链。单链DNA掺入成熟的噬菌体颗粒，颗粒不断地从感染细胞上芽生。M13感染虽不杀死细胞，但细胞的生长受到一定的抑制，所以形成混浊的噬菌斑。

单链噬菌体载体的优点①M13的感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢；②M13DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链；③M13的包装不受DNA大小的限制，其噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能进行包装。由于M13的这些特性，而使之广泛地用于DNA重组。

M13的基因组中除有一段507个核苷酸，其余都含有与其复制有关的遗传信息。因此，只有在这一段中可插入外源DNA而不致影响噬菌体的活性。插入M13的外源DNA超1000bp时就不稳定，在噬菌体增殖时会出现缺失。一般说，插入300～400bp是相当稳定的。噬菌粒载体噬粒(phagemid或phasmid)是由质粒载体和单链噬菌体载体构建成的。它们既有质粒的复制起点，又有噬菌体的复制起点。因此，在大肠杆菌细胞里，可以按正常的双链质粒分子进行复制，生成双链DNA；当存在辅助噬菌体的条件时，在噬菌体基因Ⅱ蛋白质的作用下，又可像单链噬菌体M13一样按滚环模型复制出单链DNA，并在包装成噬菌体颗粒后释放出宿主细胞。最为常用的噬粒载体有pUC118和pUCll9。两者除了多克隆位点的序列正好相反外，其余的序列都是相同的。pUC118,pUC119的优点分子量小，可以克隆高达10Kb的外源片段，并且易于体外分离与操作带有ampr抗性标记拷贝数高，可达500个存在一个多克隆位点区lacZ基因5‘端编码区质粒的复制起点M13的复制起点，ssDNA，包装，分泌到培养基pUC118,pUC119方向相反，转录正链，负链可以直接测序病毒载体猴病毒40（SV40）猴病毒40（SV40）的基因组常用来作为克隆载体，把外源DNA转入哺乳类细胞。猴病毒40是球形动物病毒，直径40nm，呈20面体，有一个共价闭环的双链DNA基因组，全长5244bp。它在猴肾中增殖。被SV40感染的细胞都会出现SV40的T抗原。早已证明完整的小鼠染色体β珠蛋白基因（包括所有的间插顺序和两侧顺序）整合在SV40中后，在被感染的猴肾细胞中都能正确地转录和翻译。表明猴肾细胞的拼接系统能有效地处理小鼠β珠蛋白的初级转录本。可是，SV40作为克隆载体有其局限性：①SV40基因组的晚期功能区的裂解性，不利于外源DNA的重组和表达；②早期功能区与病毒的致癌性有关，使用时有顾虑；③重组DNA片段的大小受体限制。逆转录病毒逆转录病毒是RNA病毒，它有三个基因：gag-编码病毒的核心蛋白；pol-编码逆转录酶；env-编码病毒的被膜糖蛋白。有的逆转录病毒还带有癌基因（vonc），即有的逆转录病毒有致癌作用。近年来，已设计构建成一些缺陷型病毒（defectivevirus）使逆转录病毒成为有用的基因载体，成功地把抗药性基因转入了人体造血前体细胞，并在细胞中表达。Hock等选用了缺失编码病毒外壳蛋白基因的逆转录病毒，因此不能合成自身的外壳，但它有识别外壳蛋白进行包装的信号（一段尚未鉴定的DNA顺序）。用这种缺陷的逆转录病毒去感染某种细胞株，这种细胞株包含有辅助病毒（helpervirus）。辅助病毒能合成蛋白外壳，但缺失了识别蛋白外壳进行包装的信号，因此它不能包装成病毒颗粒。当用逆转录病毒感染细胞株后，逆转录病毒的RNA进入辅助病毒的外壳蛋白，成为病毒颗粒。这时把受感染的细胞同骨髓细胞一起培养，包装在辅助病毒外壳蛋白中的逆转录病毒RNA，进入骨髓细胞，病毒DNA插入宿主细胞基因组，基因的活性得到表达。这时，由于骨髓细胞里面没有辅助病毒，所以整合进宿主基因组的逆转录病毒，不再有外壳蛋白可供包装，因此也就无法增殖，而只能被“陷”在宿主基因组中，通过细胞分裂而传给下一代子细胞。表达载体(expressingvector)特点：带表达构件—转录和翻译所需的DNA序列大肠杆菌表达载体：含启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号启动子：trp-lac(tac)启动子、λ噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子核糖体结合位点(ribosome-bindingsite,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列转录终止序列哺乳动物表达载体真核表达元件：启动子/增强子—克隆位点—终止信号和加poly(A)信号哺乳动物表达载体真核表达元件：启动子/增强子—克隆位点—终止信号和加poly(A)信号重组DNA技术的基本过程目的基因的制备载体的选择和制备DNA分子的体外连接将外源DNA导入宿主细胞目的基因的筛选和鉴定目的基因(targetDNA)的制备目的基因（外源基因）制备基因组DNA基因文库(genomiclibrary)—存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组DNA的集合制备cDNAcDNA文库(cDNAlibrary)制备用于表达的基因片段：PCR技术、化学合成第二节工具酶

切接转检增完整的基因克隆过程

（一）基本知识一、限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease,RE）1、定义：指一类能够识别双链DNA分子中的某特种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。2、来源:原核生物细菌的限制和修饰系统（R/M体系）限制性核酸内切酶111EcoliC10-4110-4EcoliB10-410-41EcoliKλCλBλKEcoli菌株λ噬菌体感染率RE将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。（1）限制（Restriction）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2）修饰（Modification）3.性质:内切酶,在核酸分子链的内部制造切口的酶。内切酶限制性核酸内切酶×√4.功能:自我保护作用限制性核酸内切酶细菌的限制和修饰系统（R/M体系）

111EcoliC10-4110-4EcoliB10-410-41EcoliKλCλBλKEcoli菌株λ噬菌体感染率I型限制性内切酶目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。（二）限制性内切酶的类型II类限制性内切酶III类限制性内切酶首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。（1）酶结构1.I型限制性内切酶如EcoB和EcoK。三亚基双功能酶：R:限制酶亚基M:甲基化酶亚基S:识别DNA序列亚基（2）识别位点序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.I型限制性内切酶未甲基化修饰的特异序列。需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（4）作用机理在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链。Recognizesitecut1-1.5kb（3）切割位点类型Ⅰ：大型的多亚基的蛋白质。具有内切酶的活性、具有甲基活性化酶的活性。具限制和修饰两种体系，切割位点基本上是随机。因此Ⅰ型内切酶在DNA重组研究工作中并没有什实际用处。首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。（1）酶结构相反方向结合的同源二聚体内切酶与甲基化酶分开2.II类限制性内切酶分离的第一个酶是HindⅡ（2）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文对称序列--旋转对称序列，反向重复序列）。与DNA的来源无关。2.II类限制性内切酶EcoRI：5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’EcoRI5’-G

AATTC-3’3’-CTTAA

G-5’PstI5’-CTGCA

G-3’3’