天然产物的提取分离

研究程序

有效成分的提取方法

有效成分的分离纯化方法

结构研究方法第二章天然产物提取分离方法第一节研究程序

资源调查,资料收集,样品采集天然产物的提取活性追踪天然产物的分离纯化结构鉴定一、研究程序资源调查资料收集成分预试提取有效成分分离纯化部位分离活性初筛活性追踪结构鉴定结构查新应用结构改造仿生合成经济分析技术保护高通量筛选技术二、资源调查包括资源实地调查和文献调查。资源实地调查：分布、储量、有效部位、综合利用价值、开发前景等基础资料。文献调查：旨在查阅前人（国内、国际）对同属、同科或同种植物的研究状况，如化学成分的研究方法、水平、技术条件、经验教训及进展等。植物选择：当地随机；分类学；民族医药；植化方法；信息网络；机遇。例：番荔枝内酯：研究状况1996前128个；1997：250；1998：>300抗癌药物与杀虫剂。三、成分预试依据植物体内各类化学成分的溶解性、挥发性、吸附性等差异粗分离后，再利用颜色反应、沉淀反应、气体反应、荧光反应等定性试验大致了解其中含有哪几类化合物。有单项预试和系统预试两类。有机化合物分为三类水溶性亲脂性亲水性苷类（黄酮、三萜、甾体等与糖的结合物）糖类、氨基酸蛋白质、盐类未成盐的生物碱，未成苷的黄酮、蒽醌、萜类、甾体。化合物的酸碱性酸性化合物碱性化合物两性化合物

酸性成分黄酮、蒽醌、香豆素、有机酸、鞣质中性成分强心苷、皂苷（甾体）碱性成分生物碱两性成分两性生物碱（含COOH、OH等）极性分类脂溶性成分：苷元、生物碱水溶性成分：苷、生物碱盐按溶解性分类

常见中药化学成分类型的极性各成分及其适宜的提取溶剂各成分的极性成分类型适宜的提取溶剂强亲脂性挥发油、脂肪、腊、脂溶性色素、甾醇类、部分苷元石油醚、己烷亲脂性醛、酮、醇、醌、有机酸、生物碱、树脂、部分苷元和甙类乙醚、氯仿中等极性小中大某些苷类（如强心苷）某些苷类（如黄酮苷）某些苷类（皂苷）氯仿与乙醇（2：1）乙酸乙酯正丁醇亲水性糖类、氨基酸、某些生物碱丙酮、乙醇、甲醇强亲水性蛋白质、粘液质、果胶、糖类、氨基酸、无机盐水第三节天然产物的提取根据预试和筛选结果，采用合适方法将所需成分尽可能全部从生物材料中提取出来。在这里我们对天然产物的提取着重于提取植物中的有效成分，那么，什么是有效成分呢？由于植物中含有许多化学成分，但并不是所有的成分都能起到防治疾病的作用，根据实践经验和科学认识水平，通常将植物中的化学成分分为有效成分和无效成分两类。

有效成分：一般是指具有生理活性、能用分子式和结构式表示并具有一定的物理常数（如熔点、沸点、旋光度、溶解度等）的单体化合物。如果尚未提纯成为单体化合物的，一般称为有效部分或有效部位；而与有效成分共存的其它化学成分，则一般视为为无效成分。有效成分和无效成分的划分也不是绝对的。例如鞣质，在多数中药中对治疗疾病不起主导作用，被视为无效成分，而在地榆、五倍子等中药中因其具有收敛、止血和抗菌消炎作用，则被认为是有效成分。另外，随着科学技术的发展，有些过去认为无效的成分如某些多糖、蛋白质，现已发现它们分别具有抗癌活性，故也应列为有效成分。

提取技术分类预处理技术干燥技术超微粉碎技术天然产物传统提取技术溶剂提取法水蒸汽蒸馏法升华法现代提取技术超声辅助萃取技术超临界流体萃取技术微波辅助萃取法吸附技术其它新技术一、预处理技术除杂/整形/均匀化干燥技术：阴干蒸后烘干烘干晒干微波干燥真空干燥冷冻干燥粉碎技术：超微粉碎技术例:采收加工技术对金银花质量影响金银花（FlosLonicerae）忍冬科植物忍冬（LonicerajaponicaThunb.）的干燥花蕾，是药食两用的大宗中药材。成分富含挥发油，绿原酸及其类似物等有机酸类，木犀草苷等黄酮类，神经酰胺类化合物，以及环烯醚萜及其苷类化合物等多种有效成分。其制剂对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌等有明显抑制作用。

研究内容以大白期金银花为材料，从金银花外观性状和游离氨基酸、可溶性糖、总黄酮、绿原酸等内在质量指标方面，以烘干、晒干、蒸后烘干方法为对照，对微波干燥、真空干燥、冷冻干燥等现代干燥技术的效果进行比较分析利用超临界CO2萃取法和GC-MS分析比较晒干、微波干燥和冷冻干燥对挥发油化学组成的影响。目的筛选适于金银花规模化加工的干燥技术，为提高质控技术提供依据。供试材料：忍冬花蕾干燥方法微波干燥、蒸后烘干、烘干、晒干、真空干燥、冷冻干燥指标测定浸出物量:参照药典绿原酸含量:HPLC总黄酮含量:Al(NO3)3-NaNO3比色法可溶性糖含量:硫酸－蒽酮法游离氨基酸含量:茚三酮比色法挥发油：GC-MS不同干燥技术对金银花外观性状及化学成分含量产生了不同程度的影响。微波干燥技术可作为规模化干燥加工金银花的重要方法。微波干燥蒸后干燥晒干烘干真空干燥例:对花蕾化学成分的影响--不同干燥技术绿原酸含量蒸后烘干和微波干燥>真空干燥〉冷冻干燥、烘干总黄酮含量蒸后烘干>>微波干燥和真空干燥>>其余处理。游离氨基酸含量真空干燥>烘干处理>>冷冻干燥可溶性糖含量晒干和蒸后烘干处理>>微波干燥和烘干。不同干燥技术对金银花有效成分和营养成分的影响是不同的。原因：微波干燥和蒸后烘干条件下使金银花鲜样在短时间内快速升温，多酚氧化酶迅速失活，从而使这2种技术加工而成的金银花成品中绿原酸含量较高，而其它几种干燥技术都是缓慢升温，多酚氧化酶活性先增强而后再被灭活，使金银花中绿原酸被氧化，绿原酸分解损失较大，因而绿原酸含量相对较低。冷冻干燥法对药材中的易氧化分解成分有保护作用，但实验中对冷冻干燥样品的有效成分和营养成分的含量分析却没有体现出冷冻干燥的优势。二、天然产物传统提取技术

（一）溶剂提取法定义：选用对所需成分溶解度大，而对其它成分溶解度小的溶剂，将所需的成分从植物组织内溶解出来。基本原理：细胞渗透原理。当溶剂加入到植物的原料中时，由于扩散、渗透等作用，溶剂逐渐通过细胞壁渗透到细胞之中，同时将细胞中所含的化学成分逐渐溶解，使细胞内外产生浓度差。含有化学成分的浓溶液由于扩散又从细胞中透过细胞壁而到溶剂中。新的溶剂又不断进入，如此多次往返，最终细胞内外溶液浓度达到平衡。此时，若将溶液滤出，继续加入新溶剂并使这一过程重复进行，就可将有效成分大部分溶解出来。环己烷，石油醚，苯，乙醚,氯仿，乙酸乙酯，正丁醇，丙酮，乙醇，甲醇，水极性：亲脂性：亲水性：比水重的有机溶剂：与水可以以任意比例混溶的有机溶剂：与水分层的有机溶剂：能与水分层的极性最大的有机溶剂：常用来从水中萃取苷类、水溶性生物碱类成分的有机溶剂：溶解范围最广的有机溶剂：乙醇极性最小的有机溶剂：环己烷极性最大的有机溶剂：甲醇3.溶剂选择的理论依据：“相似相溶”原则。亲水性：这种近于水的性质。亲脂性：近于油的性质。各种溶剂都有一定程度的亲水性或亲脂性。如乙醇的分子比较小，有羟基，与水的结构相似，所以能与水任意混溶。丁醇和戊醇分子中都有羟基，保持与水近似的性质，但分子逐渐变大，与水的性质逐渐疏远，所以它们虽然能溶解在水里，但这种相互溶解却有一定的限度。在它们互溶达到保和状态以后，丁醇与戊醇即与水分层。丙酮的分子也比较小，分子中的羰基是一个极性集团，所以丙酮的亲水性强，与水能完全互溶。乙醚和乙酸乙酯的性质，与乙醇比起来区别就大一些。一方面分子量增大，但增大的并不太多；另一方面醚键和酯键都和油脂相近，所以它们基本上属于亲脂性的溶剂，只是由于分子量不算太大，分子中虽然没有羟基，但仍有氧，仍然保持了一定程度的亲水性。氯仿、苯和石油醚都是烃类和氯烃衍生物，分子中根本没有氧，而且分子量比较大，所以它们和油脂的性质相似，属于亲脂性溶剂。植物中的有效成分（天然产物）在溶液中的溶解度与其化学结构、性质及溶剂的性质有很大的关系。溶解度化学性质稳定安全、价廉4.溶剂的选择条件：-①溶剂对所需成分溶解度大，对杂质溶解度小。②与植物中化学成分不起化学反应。③溶剂要经济易得，可回收，使用安全，不污染环境。5.常用提取溶剂分为：水、亲水性和亲脂性有机溶剂。常用溶剂极性：由弱到强依次排序为石油醚＜四氯化碳＜苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜正丁醇＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水①水：强极性溶剂。

植物材料中的无机盐、(分子量不太大的)糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐及甙类等均可被水溶出。酸水性有利于提取生物碱；碱性水有利于溶出有机酸、黄酮、蒽醌、内酯、酚类等。水作溶剂的主要缺点：易霉变由于水提取液中常含有糖类、蛋白质、氨基酸等物质，有利于微生物的生长，故易发生霉变。因此，若提取时间较长时，应加入少量防腐剂（如甲苯、甲醛、氯仿等）防腐。难以过滤果胶及粘液质、淀粉类物质的存在使水提液难以过滤，可加入助滤剂如1%—2%的经过110℃活化1小时的热滑石粉或硅藻土（使胶质分散）等，进行减压过滤。-易提取不完全次生物质有许多为亲脂性成分，溶解度小，不易提取完全。-杂质较多-难浓缩当水提取液中含有皂甙及其粘液质类成分时，减压浓缩会产生大量泡沫，造成浓缩困难，在实验室中，可在水提液中加入少量丁醇或戊醇以防止泡沫产生；也可采用旋转蒸发器、薄膜浓缩法、喷雾干燥法等加快浓缩速度；对于蛋白质等不稳定物质，可采用冰冻干燥法。

助溶现象（增溶现象）在提取有效成分时，提取液中存在着复杂的混合物，其中各成分互相影响，有时就会产生增溶现象，增大了欲提取物的溶解度。但是有时又可能由于化合物的相互作用生成了一些难溶解的化合物，改变了所要提取的化合物的溶解性而使其提取不出来。②亲水性有机溶剂如乙醇、甲醇、丙酮等能与水混溶的有机溶剂。乙醇最常用，溶解性能好，对细胞穿透能力较强。亲水性成分除蛋白质、粘液、果胶、淀粉和部分多糖外，大多能在乙醇中溶解。难溶于水的亲脂性成分，在乙醇中溶解度也较大。不同浓度的乙醇对各种化学成分的溶解度不同。如20％~30％的乙醇可溶解生物碱盐和蒽醌；40％~50％的乙醇可溶解强心甙和鞣质；60%~70％的乙醇适用于甙类的提取；95％的乙醇则是提取叶绿素、挥发油等的良好溶剂。

总之，乙醇的浓度越大，则溶解亲脂性成分越多；乙醇的浓度越小，则溶解亲水性成分越多。用乙醇作提取溶剂的优、缺点：提取时间短、溶出杂质（蛋白质、多糖）少。提取液不易发霉变质。乙醇挥发性大，浓缩容易，用量小，且大部分可回收再用。价廉，毒性小、来源方便。缺点：易燃、损失较大

③亲脂性有机溶剂如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯等不与水混溶的有机溶剂。它们可以提取植物中的亲脂性成分，如油脂、挥发油、叶绿素、树脂、植物甾醇、内酯、某些生物碱及苷元（如甾体苷元、黄酮、蒽醌等）。石油醚→油脂、蜡、叶绿素、挥发油、游离甾体及三萜类化合物。氯仿或醋酸乙酯→游离生物碱、有机酸及黄酮、香豆素的苷元。优点沸点低，浓缩回收方便，选择性强，容易得到纯品。缺点—挥发性大，多易燃有毒，价格昂贵。—透入植物组织能力较弱，提取时间长。若植物材料中含有较多水分，就很难溶出次生物质。因此，直接应用这类溶剂提取有一定的局限性。6.提取方式浸渍法（冷浸）煎煮法（热提）回流法（有机溶剂）连续提取法渗漉法（连续冷浸）①浸渍法：冷浸或温浸，常用水或乙醇，每次浸泡３～５日，浸泡２－３次。本法操作简便，适宜于遇热不稳定易分解或破坏的成分的提取。但此法提取时间长，溶剂用量大，提取效率不高。

6.提取方式

②渗漉法：将植物材料粉末加入适量浸出溶剂润湿，装入渗漉筒内，压实后，在上端不断添加溶剂，使之渗过材料，溶出的可溶性成分即从下口流出。优点是提取效率高，但提取费时，提取液体积太大，浓缩困难。有渗漉筒和渗漉罐两种。渗漉法适用于提取热敏性、挥发性或剧毒类成分和有效成份含量较低或要求浸出液浓度较高的物料,不宜用于黏性的不易流动的物料。

实验室常用仪器：渗漉筒；分液漏斗；粗色谱柱等。操作步骤：粉碎→润湿→拌匀→静置（30min）→装料→压实→添加溶剂→静置（6h）→渗漉注意事项：

流速：随物料多少定，如100g料，可控制1mL/min。终点判定：颜色或体积(10倍)渗漉法操作注意事项：1、植物材料的粉碎度要合适，不宜太细或太粗。太粗会影响提取的效率，太细则容易结块而阻塞溶剂流通。2、向渗漉桶中装料前应加入适量的溶剂使其完全湿润，以避免植物粉末在渗漉桶被因加入溶剂后膨胀而造成堵塞。3、装料时要分次加入，一层层压紧，压力要均匀，装到渗漉桶2/3时，上面压一层纱布，再用一层沙子压住，以免加入溶剂时，原料上浮。4、在渗漉前要浸泡24小时再有，以提高渗漉效率。5、收集渗漉液时，要不断加入新鲜的溶剂，并经常检查所要提取的成分是否已经提取干净，若是未知成分的植物样品，可根据渗漉液的颜色和体积进行判断。与浸渍法相比，渗漉法可使植物材料与新溶剂或有效成分含量低的溶剂接触，具有一定的浓度差，提高了提取效率，提取效果优于浸渍法。③煎煮法杂质多，破坏性强，水煎液易霉变、腐败，不宜存放。火的使用：火的强弱与提取液质量有密切的关系。火力过强提取液温度增高，溶出速度加快，水分蒸发得快，芳香挥发性有效成分易随水蒸汽挥发掉；而根、茎、甲壳、矿石类质地坚硬的药物，煎煮时间过短药材成分不易充分煎出，且容易烧焦；火力过弱则温度较低，不易使药物有效成分煎出。正确使用火力对汤剂的质量有重要作用，一般未沸前用武火，沸后改用文火，以增加煎出效果并减少水分的蒸发量。

中药汤剂的质量与选用的煎药器具有密切的关系。现在仍是以砂锅为好，因为砂锅的材质稳定不会与药物成分发生化学反应，其传热均匀缓和，比较适宜。此外也可选用搪瓷锅，不锈钢锅和玻璃煎器。但是不能使用铁锅、铜锅，主要是因为铁锅或铜锅的化学性质不稳定，易氧化。在煎煮药时能与中药所含的化学成分发生反应，如与鞣质类的成分可生成鞣酸铁，使药液的颜色加深。与黄酮类成分可生成难容性聚合物。与有机酸类成分可生成盐类。④回流提取法

用有机溶剂进行加热提取时，需要采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。在实验室中小量操作时，可将植物材料放入大小适宜的烧瓶中（体积约为烧瓶容量的1／3—1／2），烧瓶上接一个冷凝器，加入溶剂，在水浴中加热回流，1小时后，滤出提取液，加入新溶剂，再回流提取，时间可比第一次短，一般反复两次即可。大量生产中可采用类似的装置。此法较冷浸法提取率高但对受热易破坏的成分，对受热易破坏的成分不利，不宜采用此法。⑤连续回流提取法

为了弥补回流提取法中要进行反复过滤、需要溶剂量大的不足，可采用连续回流提取法。连续回流的装置，实验室常用索氏提取器。由于溶剂可反复被气化、冷凝，使被提取物与溶剂之间一直保持着相当大的浓度差，提取效率高，溶剂用量少，在水、电正常的实验室中无需人监督，提取过程可自动进行。索氏提取器适于少量植物材料的提取(最大为数十克)。大量提取时可根据其提取原理设计类似的装置，此法的不足之处是提取液受热时间较长，对受热易分解的成分不宜采用此法。索氏提取器1．冷凝管2．溶剂蒸气上升管3．虹吸管4．装有药粉的滤纸袋5．溶剂6．水浴（二）水蒸汽蒸馏法是将水蒸气通入含有挥发性成分的植物材料中，使其中挥发性成分随水蒸气蒸馏出来的提取方法。水蒸气蒸馏法是提取植物成分的一种常用的方法，挥发油、某些小分子生物碱（如麻黄碱、烟碱等）和小分子酚性物质（如丹皮酚等）等都可采用本法提取。1、基本原理道尔顿（Dalton）分压定律：水与另一种与其不溶的物质一起加热时，总的蒸气压应为各成分蒸气压之和，即P总＝P水十P物，这样，当混合物的总蒸汽压等于外界大气压时的温度即为该混合体系的沸点。此时的沸点必定比任何一个单独组分的沸点都要低。因此，可以将不溶解于水的沸点比较高的组分在100℃以下与水一起蒸馏出来。例如，溴苯和水组成的混合物沸点为95℃，而溴苯的沸点为135℃。蒸馏中混合物的沸点保持不变，直到其中一个组分几乎全部蒸出，温度才上升到留在瓶中液体的沸点。在蒸馏出的混合蒸汽中，两个组分的气体分压P水与P物之比等于两组分的蒸汽在同一容积的体系中的摩尔数n水和n物之比。n水/n物=P水/P物问题：

某有机化合物的分子量为88，沸点132℃，它微溶于水，它与水的混合沸点为93℃，在此温度下，它的蒸汽压为23.46KPa，水的蒸汽压为78.28KPa，试计算馏出液中水和有机物的质量比？2.条件（1）沸点多在100℃以上。（2）能随水蒸气蒸馏而不被破坏，并且不与水发生反应，难溶或不溶于水。（3）在100℃时有一定的蒸气压，至少有0.667~1.333Kpa(5~10mmHg)的蒸气压。有些挥发性成分在水中溶解度稍大些，可将蒸馏液重新蒸馏，在最先馏出的部分分出油层，或在蒸馏液水层经盐析法并用低沸点溶剂将成分提取出来（如玫瑰油、原白头翁素等）。酰氯、酸酐或酯类化合物能否采用此法？2.装置有蒸汽发生器、蒸馏瓶、冷凝装置和接液瓶组成。

（三）升华法某些固体物质在低于其熔点的温度下加热，不经过中间液体阶段，可直接气化，冷凝后又变为原来的固体，这种现象称之为升华。中草药中有一些成分具有升华的性质，可以利用升华法直接自中草药中提取出来。如樟脑、咖啡因。升华法虽然简单易行，但适应面较窄；再加上植物材料在升华过程中炭化后往往产生焦油状物，与升华物混在一起，不易除去，有时升华不完全，并伴随分解现象。因此较少采用。

若物质在三相点温度以下蒸气压已相当大，可以容易地从固态直接转变为气态，则此物质可容易地用升华方法来纯化。如樟脑的三相点温度为179℃，压力49329Pa（370mmHg），而在160℃时其蒸气压已达29166Pa（218.8mmHg）。只要逐渐缓慢加热，使温度维持在179℃以下，就可以使樟脑由固态直接气化，蒸气遇冷的表面又凝结为固体。操作关键是加热速度慢、匀、稳，否则蒸气压会超过三相点的压力，物质将会由固体直接转变为液体，导致升华失败。三、现代提取技术

1.超声促提技术超声提取法是一种利用外场介入强化提取过程，用溶媒进行天然产物提取的一种方法。超声波是频率高于20kHz，并且不引起听觉的弹性波。超声促提技术优点1.提取效率高：超声波独具的物理特性能促使植物细胞组织破壁或变形，使有效成分提取更充分，提取率比传统工艺显著提高达50—500%。2.提取时间短：超声波强化中药提取通常在24—40分钟即可获得最佳提取率，提取时间较传统方法大大缩短2/3以上，药材原材料处理量大。3.提取温度低：超声提取中药材的最佳温度在40—60℃，对遇热不稳定、易水解或氧化的药材中有效成分具有保护作用，同时大大节能能耗。4.适应性广：超声提取不受成分极性、分子量大小的限制，适用于各类成分的提取。5.提取药液杂质少，有效成分易于分离、纯化。6.提取工艺运行成本低，综合经济效益显著。7.操作简单易行，设备维护、保养方便。理论基础：空化效应、热效应和机械作用。空化效应：当大能量的超声波作用于液体时，使液体被撕裂成很多小的孔穴，而这些孔穴在闭合时能产生高达几千个大气压的瞬时压力而作用于植物组织。超声空化作用产生局部高温、高压,并伴随有破碎、搅拌等作用，增强物质溶出能力。2、超临界流体萃取技术(SuperiticalFluidExtraction

，SFE)

超临界流体萃取法始于20世纪50年代，到70年代末，该法广泛应用于烟草和食品工业，80年代以来，超临界流体萃取技术在医药、化工、食品及环保等领域取得了迅速发展，特别是在中药有效成分提取分离方面日益受到重视。目前主要用于萜类、挥发油、生物碱、黄酮、苯丙素、皂苷和芳香有机酸等成分的提取分离。在青蒿素浸膏、蛇床子浸膏、胡椒精油、肉豆蔻精油等的制备分离方面已达到产业化规模。这种流体(SCF)兼有气液两重性的特点，它既有与气体相当的高渗透能力和低的粘度，又兼有与液体相近的密度和对许多物质优良的溶解能力。相密度(g/ml)扩散系数(cm2/s)粘度(g/cm.s)气体(G)10-3

10-1

10-4

超临界流(SCF)0.3～0.910-3～10-4

10-4～10-3

液体(L)110-5

10-2

。

超临界流体萃取是利用流体在超临界状态时具有密度大、粘度小、扩散系数大等优良的传质特性而成功开发的。具有提取率高、产品纯度好、流程简单、能耗低等优点。

超临界流体萃取正是利用了这个特性，形成了新的分离工艺。它是经典萃取工艺的延伸和扩展。

流体在临界区附近，压力和温度的微小变化，会引起流体的密度大幅度变化，而溶质在超临界流体中的溶解度大致上和流体的密度成正比。常用的SCF为CO2，因为CO2无毒，不易燃易爆，价廉，有较低的临界压力和温度，易于安全地从混合物中分离出来。超临界CO2萃取法的优点可在近常温的条件下提取分离，几乎保留产品中全部有效成分，无有机溶剂残留，产品纯度高，操作简单，节能。超临界CO2萃取的特点可以在接近室温(35-40℃)及CO2气体笼罩下进行提取，有效地防止了热敏性物质的氧化和逸散，完整保留生物活性，而且能把高沸点，低挥发渡、易热解的物质在其沸点温度以下萃取出来。由于全过程不用有机溶剂，因此萃取物绝无残留溶媒，同时也防止了提取过程对人体的毒害和对环境的污染，100%的纯天然，符合当今“绿色环保”、“回归自然”的高品位追求。控制工艺参数可以分离得到不同的产物，可用来萃取多种产品，而且原料中的重金属、无机物、尘土等都不会被CO2溶解带出。二氧化碳超临界萃取的溶解作用：在超临界状态下，CO2对不同溶质的溶解能力差别很大，这与溶质的极性、沸点和分子量密切相关。规律：亲脂性、低沸点成分可在104KPa以下萃取，如挥发油、烃、酯、内酯、醚、环氧化合物等，像天然植物和果实中的香气成分，如桉树脑、麝香草酚、酒花中的低沸点酯类等。化合物的极性基团(如-OH、-COOH等)愈多，则愈难萃取。强极性物质如糖、氨基酸的萃取压力则要在4×104KPa以上。化合物的分子量愈大，愈难萃取。分子量在200～400范围内的组分容易萃取，有些低分子量、易挥发成分甚至可直接用CO2液体提取；高分子量物质(如蛋白质、树胶和蜡等)则很难萃取。

若采用C02萃取极性物质，就需将其改性，常用改性方法有两种：

1．流体改性：向C02中加入少量极性溶剂(改性剂)，增加混合流体的极性。

2.基体改性：直接将改性剂加到样品基体中。当被萃取物与样品基体较强地结合在一起时，这种方法更为有效。C02改性方法：

该流程包括如下几部分：1.高压泵。2.萃取池。3.限流器（阻尼器）4.收集器。SFE萃取的基本流程第四节分离纯化方法与技术物质的溶解度差别进行分离物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离根据物质的吸附性差别进行分离根据物质分子大小差别进行分离经典分离纯化方法系统溶剂分离法、两相溶剂萃取法、沉淀法、盐析法、透析法、结晶法、分馏法现代分离纯化技术现代色谱方法和技术野树波罗根粗粉(5.4Kg)95％乙醇提取浸膏642g564g水混悬石油醚部位

31.9g氯仿部位

223g乙酸乙酯部位

16.6g水层139.8g反复正反硅胶柱层析14个异戊烯基酚性化合物新化合物一、经典分离纯化方法1.系统溶剂分离法通常由亲脂性到亲水性或低极性到高极性的次序组成溶剂系统，依次提取分离各种不同的成分。利用极性不同的溶剂提取，各种化学成分将被分成不同的部位（分）。仅仅是一种粗分，获得的也是混合物。各成分及其适宜的提取溶剂各成分的极性成分类型适宜的提取溶剂强亲脂性挥发油、脂肪、腊、脂溶性色素、甾醇类、部分甙元石油醚、己烷亲脂性醛、酮、醇、醌、有机酸、生物碱、树脂、部分甙元和甙类乙醚、氯仿中等极性小中大某些甙类（如强心甙）某些甙类（如黄酮甙）某些甙类（皂甙）氯仿与乙醇（2：1）乙酸乙酯正丁醇亲水的甙、糖类、氨基酸、某些生物碱丙酮、乙醇、甲醇强亲水性蛋白质、黏液质、果胶、糖类、氨基酸、无机盐水

系统溶剂分离法是研究成分不明、无资料可循的植物最常用的方法，其缺点是操作程序较繁，且耗费溶剂和时间。

两相溶剂萃取法

（1）简单萃取法①定义:利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而达到分离的方法。一般从水提液中(悬浮液)中萃取脂溶性成分。②分类:分为简单萃取法(即用分液漏斗)、连续萃取法、逆流分溶法(CCD)和液滴逆流分配法(DCCC法)。分离技术愈来愈复杂，但效果却愈来愈好。③分配系数：K=C上/C下④分离因子：β=KA/KB（KA>KB），表示分离难易一般β>100，简单萃取。

β<50，CCD法（后述）。

β=1，无法分离⑤萃取溶剂的选择A萃取剂对被萃取物质有很大的溶解度，而对非萃取组分或杂质有极小的溶解度。当被萃取物水溶性较小时，用石油醚萃取；水溶性稍大的物质可用苯或乙醚萃取；水溶性大的物质可用乙酸乙酯萃取。B萃取溶剂与溶液的溶剂不互溶或微溶，两溶剂的密度差异明显。C溶剂与混合物不起化学反应。D萃取后溶剂便于用常压蒸馏回收。E价格低廉，毒性小，不易着火。⑥分次萃取操作的注意事项：A.水提取液的浓度最好在比重1.1~1.2，否则溶剂用量过大，影响操作。B.溶剂与水要保持一定的比例，第一次萃取时，溶剂可多加一些（水提取液的1/3），随后的用量可少一些（1/4~1/6）；C.萃取次数为3~4次，但对亲水性较大的，不容易转入有机溶剂层的沉浮，需要增加萃取次数。D.用氯仿萃取，易产生乳化现象，在碱性情况下尤甚。⑦乳化现象产生的原因：①因振荡太剧烈，使一相在另一相中高度分散，形成乳浊液，因此在处理易乳化的体系时，以将分液漏斗慢慢地反复颠倒数次，比剧烈振荡为好。②反应生成某种微溶化合物，既不溶于水相，也不溶于有机相，以致在界面上出现沉淀，形成乳浊液。③金属离子水解析出胶状沉淀。⑧防止乳化现象的方法

将乳状液分出，在换新溶剂萃取。将乳状液抽滤。将乳状液加热或冷冻。加入一种表面活性更大的表面活性剂，将原来的乳化剂自油-水界面上顶替出来，但它本身不能形成牢固的保护膜，因而乳状液的稳定性降低，从而导致乳状液的破坏。如戊醇（增强其表面张力）。如果乳化现象严重，则可采用逆流连续萃取装置。⑵CCD法（Countercurrentdistribution，逆流分溶法）：

是一种多次连续的液-液萃取分离过程。⑶DCCC(液滴逆流色谱)和HSCCC(高速逆流色谱法)

是在逆流分溶法基础上创建的色谱装置，可使流动相呈液滴形式在固定相间交换，分离效果好。多用于分离皂苷、蛋白质、糖类等。3.沉淀法（1）铅盐沉淀法由于醋酸铅和碱式醋酸铅能与多种成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，从而达到与杂质分离的目的。中性醋酸铅能与酸性物质(如酸性皂甙)或酚性物质(如黄酮)结合成不溶性盐。碱式醋酸铅能使中性皂甙等多种成分产生不溶性铅盐或络合物，再进行脱铅处理即可。被铅盐沉淀的有机物的脱铅方法：1．通硫化氢气体，使铅生成硫化铅沉淀出来，直到滤液中通硫化氢不再生成沉淀为止。过滤，沉淀用水洗，洗液与滤液合并，在水浴上加热赶去过量的硫化氢，也可用抽真空的方法除去过量硫化氢。2．加入磷酸或稀硫酸，调节pH在3，使铅与磷酸根或硫酸根结合生成沉淀而被除去。但因磷酸铅和硫酸铅在水中仍有一定的溶解度，故脱铅不彻底。3．加入阳离子交换树脂搅拌，脱铅速度快且彻底，但是有些有效成分也可能被交换上去，同时脱铅树脂再生也比较困难。（2）乙醇沉淀法在浓缩的水提取液中，加入一定量的乙醇，使不溶解于乙醇的成分沉淀出来而与水溶液中其他物质分离的方法。这种方法可以用来沉淀淀粉、树胶、蛋白质、粘液质等成分。醇沉法又分为一次醇沉法和分步醇沉法。如我们在提取杜仲叶中绿原酸时，加入乙醇使其含量达80%左右，提取液中的蛋白质、粘叶质等杂质沉淀析出，静置，过滤，滤液浓缩至干即得绿原酸粗品。此法可使提取物中的绿原酸含量从15%提高到近20%。如果采用分步醇沉的方法，使浓缩物中的乙醇含量依次达到一定的浓度（如60%、70%、80%），分别将每次所得沉淀除去。用这种方法得到的提取物中的绿原酸含量比一次醇沉法的要高一些。

（3）酸碱沉淀法是利用植物中的某些成分在酸（或碱）中溶解，在碱（或酸）中沉淀的性质而将这些成分分离出来的方法。例如，不溶于水的内酯类化合物，遇碱开环（有时须加热）生成羟基羧酸盐而溶于水，再加酸酸化，则重新环合成内酯而从溶液中沉淀析出，借以与其它成分相分离。

又如游离的生物碱一般难溶于水，遇酸生成生物碱盐而溶于水中，再加碱碱化，则重新生成游离生物碱从溶液中析出而与其它成分相分离。此外，分离生物碱还常用雷氏铵盐等试剂沉淀法分离；分离橙皮苷、芦丁、黄芩苷、甘草皂苷等常先溶于碱性溶液，再加酸使之沉淀；其它沉淀试剂如苦味酸、氢氧化铜、氯化钙和石灰能和有机酸、苷类、及氨基酸等生成不溶于水的沉淀，与其它化合物分离。如从番泻叶提取物中分离纯化番泻甙时，即用氯化钙作为沉淀剂。4.盐析法向水提取液中加入无机盐，使达饱和浓度，可使某些成分在水中的溶解度降低而析出，从而与水溶性杂质分离。常用做盐析的无机盐氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等如自三颗针中提取小檗碱在生产上都是向提取液中加氯化钠或硫酸铵来盐析制备。5.透析法利用提取液中的小分子或离子易透过半透膜，而大分子、大离子不能透过的性质而达到分离的方法。原理：透析是采用半透膜作为滤膜,使试样中的小分子经扩散作用不断透出膜外,而大分子不能透过被保留，直到膜两边达到平衡。半透膜有动物性膜、火棉胶膜、玻璃纸膜和蛋白胶膜(明胶)等。特点：半透膜两边均为液体，一边为试样溶液，另一边为纯净溶剂（水或缓冲溶液）。可不断更换外层溶剂使扩散不断进行，直至符合要求分离纯化皂甙、多糖、蛋白质、多肽等在其中加一电磁场并进行搅拌，使透析速度加快，称为电透析法Electrodialysis应用：制备或提纯生物大分子时，除去小分子物质及其杂质，脱盐。用于透析的半透膜应具备的条件：

在溶剂中能膨胀形成分子筛状多孔薄膜，只允许小分子溶质通过，而阻止大分子（如蛋白质）通过；化学惰性；在水、盐溶液、稀酸或稀碱溶液中稳定；有一定的机械强度和良好的再生性能。半透膜可制成管状，按需要截取一定长度，将一端封闭后，装入需要透析的试样溶液后，放入盛有溶剂的透析缸中商品透析管常涂有甘油以防干裂，也可能含有其他微量杂质。预处理：用50%乙醇慢慢煮沸一小时，再分别用50%乙醇、0.01mol/L碳酸氢纳溶液、0.001mol/LEDTA溶液依次洗涤，最后用蒸馏水洗涤三次。透析过程注意点：透析前，对装有试液的透析袋检查是否有泄漏；透析袋装一半左右，防止膜外溶剂因浓度差渗入将袋涨裂或过度膨胀使膜孔径改变；搅拌；定期或连续更换外部溶剂可提高透析效果。6.结晶法次生物质在常温下达到一定纯度时，在合适溶剂中都具有结晶化的通性。从非晶状物质经过溶解、除杂，静置后析出晶状物质的过程将为结晶，利用反复结晶的方法，从不纯晶体制得纯度高晶形好的结晶物的过程称为重结晶。完好晶体是该化合物具有一定纯度的基本标志。结晶过程：①将需要纯化的物质溶解于沸腾或接近于沸腾的合适溶剂中，制成饱和的浓溶液；②若溶液中含有色杂质，可加活性碳等吸附剂脱色；③将溶液趁热过滤，除去不溶物及吸附剂；④将溶液冷却，使结晶自饱和溶液中析出，而可溶性杂质仍留在母液中；⑤抽气抽滤，从母液中将结晶分离，洗涤结晶以除去吸附的母液。干燥后通过测定熔点来确定是否纯品，苦发现纯度不符合要求时，可重复以上操作至熔点不再改变。

被提纯物在加热和常温下溶解度之差越大，重结晶回收率越高。假设有10g固体有机物，其中被提纯物A有9.5g,杂质B有0.5g。在室温下这两种物质的溶解度有三种情况，即B物溶解度大于A，或B物溶解度小于A，或等于A的溶解度。第一种情况为杂质溶解度大于被提纯物。设常温下杂质B溶解度为2.5g/100mL，A物溶解度为0.5g/100mL。若A在加热到沸腾时9.5g可以溶解在100mL溶剂中，在冷却到室温后，杂质仍全部溶在母液中，而被提纯物有0.5g溶在母液中，可以析出9g结晶。A物损失0.5g，回收率为94.7%。若加热到沸腾时，9.5gA可溶于50mL溶剂，则应该用50mL溶剂来重结晶。此时，0.5g杂质仍全留在母液中，而留在母液中的A物为0.25g，析出9.25g，回收率97.4%。重结晶用溶剂:单一溶剂/混合溶剂①对要结晶的物质冷时溶解度大，热时溶解度小。②对杂质无论在冷时热时，要么溶解度很大，要么溶解度很小。③不与所分离的物质产生化学反应。④沸点不宜过高，有一定的挥发性。混合溶剂选择一般由两种能以相互比例互溶的溶剂组成，其中一种较易溶解待结晶的物质，另一种较难溶解。具体方法是将提取物用接近沸点的易溶解的溶剂溶解，若有不溶物要趁热滤去。然后滴加热的难溶的溶剂，直至溶液产生混浊不再消失。再稍加热一下或滴加溶解度大的溶剂到刚好使溶液透明为止。低温放置即可析出结晶。—种方法是选择对样品易溶的低沸点溶剂和难溶的高沸点溶剂，直接将样品溶于两种的混合液中，适当放置，塞紧瓶塞，观察有无结晶生成，如无结晶，再打开瓶塞，使低沸点溶剂在室温自然挥发，慢慢即有晶体析出。常用混合溶剂有水：乙醇，乙醇：乙醚，石油醚：苯，水：丙酮；乙醚：乙醇：乙酸乙酯，石油醚：乙醚等。7.吸附法吸附法是利用吸附剂吸附杂质，也可用于吸附所需的有效成分的一种分离方法。用来吸附有效成分时，可将一定量的吸附剂装入层析柱中，将提取液通过层析柱，或将定量的吸附剂加入提取液中，搅拌后放置，过滤。再选用适当的溶剂将有效成分从吸附剂上洗脱下来，经浓缩，结晶，得有效成分。如用吸附剂吸附杂质，可将加入吸附剂的溶液过滤，杂质同吸附剂一同除去，滤液浓缩后即得有效成分。常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、硅藻土、氧化镁、活性炭和大孔树脂等。

（1）分类物理吸附也叫表面吸附，因构成溶液的分子与吸附剂表面分子的分子间力的相互作用所引起。特点：无选择性，吸附与解吸过程可逆，且可快速进行，在实际工作中用的最广。常见的吸附剂类型有：硅胶、氧化铝及活性炭。化学吸附如黄酮等酚酸性物质被碱性氧化铝的吸附，或生物碱被酸性硅胶的吸附等。特点：具有选择性，吸附十分牢固，有时甚至不可逆，应用较少。半化学吸附如聚酰胺对黄酮类、醌类等化合物之间的氢键吸附，力量较弱，介于物理吸附和化学吸附之间，也有一定应用。硅胶、氧化铝为极性吸附剂，具有以下特点：对极性物质具有较强的亲和能力。故同为溶质，极性强者将被优先吸附。溶剂极性越弱，则吸附剂对溶质将表现出越强的吸附能力。溶剂极性增强，则吸附剂对吸附能力随之减弱。溶质即使被硅胶、氧化铝吸附，但一旦加入极性较强的溶剂时，由可被后者置换洗脱下来。活性炭为非极性吸附剂，故对非极性物质具有较强的亲和能力，在水中对溶质表现出强的吸附能力。溶剂极性降低，则活性炭对溶质的吸附能力也随之降低。故从活性炭上洗脱被吸附物质时，洗脱溶剂的洗脱能力将随溶剂极性的降低而增强。（2）大孔吸附树脂大孔吸附树脂一般为白色球形颗粒状，粒度多为20-60目，通常分为非极性和中极性两类，不溶于水、酸、碱及有机溶媒。在水和有机溶剂中可以吸收溶剂而膨胀，在室温下对稀酸稀碱稳定。从显微结构上看，大孔吸附树脂包含有许多具有微观小球组成的网状孔穴结构，这些球体的构成，多为苯乙烯型和2-甲基丙烯酸酯型，前者为非极性树脂，后者为中极性树脂。大孔吸附树脂的“孔径”是指微观小球之间的平均距离。其“比表面积”是指微观小球表面积的总和。由于吸附性和筛选原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而达到分离的目的。吸附性是由于范德华力或产生氢键的结果。筛选性是由于其本身多孔性结构决定的。因为有这样的两重性，大孔吸附树脂使中药化学成分，尤其是水溶性成分的提纯得到大大简化。常用大孔树脂型号

D-101型、DA-201型、MD-05271型、GDX-105型、CAD-40型、XAD-4型、SIP系列，D-型等。常用的吸附树脂有：D-101型、DA-201型，D-型。

影响大孔吸附树脂吸附、分离的因素：（1）树脂化学结构的影响树脂的极性(功能基)和空间结构(孔径、比表面积、孔容)是影响吸附性能的重要因素，一般非极性化合物在水中可以为非极性树脂吸附，极性树脂则易在水中吸附极性物质。在一定条件下，化合物的体积越大，其吸附力越强。（2）被吸附的化合物结构的影响一般来说，被吸附化合物的分子量大小和极性的强弱直接影响到吸附效果。在同一种树脂中，树脂对体积较大的化合物吸附作用较强。如D型及DA-型树脂对多糖的吸附作用就较单糖和双糖大。当化合物的极性基团增加时，树脂对其吸附力也随之增加，如果树脂和化合物之间能发生氢键作用，吸附作用也将加深。

（3）溶剂的影响被吸附的化合物在溶剂中的溶解度对吸附性能也有一定的影响。通常一种物质在某种溶剂中的溶解度大，树脂对此物质的吸附力就小。如有机酸盐或生物碱盐在水中的溶解度很大，树脂对其吸附能力就弱。

酸性化合物在酸性溶液中进行吸附，碱性化合物在碱性溶液中进行吸附。使用过的树脂再生时，常采用稀酸或稀碱溶液洗涤也是为了增大被吸附的化合物溶解度，从而降低吸附力达到再生的目的。

（4）洗脱剂的影响根据极性“相似相溶”原理，对非极性大孔吸附树脂来说，洗脱剂极性越小，其洗脱能力越强，而对于中极性大孔树脂和极性较大化合物，则用极性较大的溶剂较为合适。（5）上柱液浓度、pH值及外界温度对大孔吸附树脂吸附纯化的影响提取液的浓度及外环境的温度都会不同程度的影响吸附纯化的过程和结果，浓度增加，有效成分在树脂上的比吸附量也相应增加。另外温度升高，树脂的比上柱量下降，说明中药成分在树脂上的吸附为放热过程，低温有利于吸附容量的提高，但在室温下，温度对比吸附量的影响较小。吸附树脂的预处理

市售大孔树脂一般喊有未聚合的单体、致孔剂、分散剂、和防腐剂等，使用前必须经过处理。以甲醇、乙醇或丙酮连续洗涤数次，至洗涤液加适量水无白色浑浊现象（取1ml甲醇液加5ml水），再用蒸馏水洗至无醇，即可。如果洗涤不彻底，则会降低树脂的吸附力。树脂的再生

用醇或95%乙醇洗脱树脂柱至流出液为无色后，树脂柱即已再生，然后以大量水洗去醇。若树脂颜色变深，可自柱上端加入5%氢氧化钠水溶液或5%盐酸水溶液洗脱，最后用水洗至下口流出液为中性即可使用。如果柱上方沉积有悬浮物，影响流速，可用水或甲醇从柱下方进行反洗，以便把悬浮物顶出。二、现代分离纯化技术

层析是一种现代的物理化学分离、分析技术，它既可用于混合物的分离和成品的纯度检查，又可用于化合物的定性和定量；尤其是对天然产物中结构类似的成分，用一般结晶、沉淀、液-液萃取等方法难以得到较好的分离时，采用层析法往往可获得满意的结果。1906年植物学家茨维持（M.Tswett）在研究植物的色素成分时，采用一根直立的管内填充了碳酸钙的玻璃柱作为分离工具，把植物绿叶的石油醚浸取液加到柱的顶端，然后用石油醚洗脱。结果发现植物叶色素在玻璃柱中被分成几个具有不同颜色的谱带。在碳酸钙柱上混合色素被分成不同色带的现象，象一束光线通过棱镜时被分成不同色带的光谱现象一样，因此他把这种现象称为色谱，而相应的方法称为色谱法（Chromatography）。色谱法又叫色层法，层析法。利用各组分物理化学性质的不同，在流动相流经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分配或其它亲和力的差异而产生不同速度的移动，最终达到分离的目的。chroma（色彩）graphy（图谱）chromatography（色谱法）定义：

效率高灵敏度高能把性质相似的物质彼此分开适合于干扰组分存在的混合物的分离分析色谱法特点：2.色谱法分类a

两相所处的状态b分离机理c操作类型a.两相所处的状态流动相固定相类型液相色谱液固l-s色谱液液l-l色谱气相色谱气固g-s色谱气液g-l色谱b：色谱法分离机理不同吸附色谱分子排阻色谱分配色谱离子色谱c：操作类型柱色谱(Columnchromatography):HPLC,GCetc.平板色谱(Planarchromatography):TLC,PC发展趋势色谱法发展趋势新型固定相和检测器。色谱新技术的研究发展趋势毛细管电色谱（CEC）色谱专家技术手性色谱光色谱联用技术GC-MS，GC-FTIRLC-MS等微流控芯片分析系统新技术一.液－固吸附柱色谱法1.基本概念固体吸附剂:多孔性物质,表面有许多吸附中心。吸附:溶质在液-固或气-固两相的交界面上集中浓缩的现象。定义:以固体吸附剂为固定相，利用被分离组分对固定相表面活性吸附中心吸附能力的差异而实行分离的色谱法。定义:

将固体吸附剂装在管状柱内，用液体流动相进行洗脱的色谱法。（1）吸附色谱法（adsorptionchromatography)（2）液－固吸附柱色谱法X:溶质分子Y:流动相分子a:吸附剂m:流动相流动相大量的,可视为常数。

组分Ka越大，tR越长2.基本原理3.吸附剂的选择和吸附活度吸附剂的要求表面积大，具有一定吸附能力不与流动相发生化学反应粒度要细，200目左右（1）氧化铝常用吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等酸性分离酸性物质，如氨基酸中性分离生物碱，挥发油碱性分离碱性物质，如生物碱（2）硅胶吸附能力稍弱于氧化铝,用于分离弱酸和中性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等。吸附能力：Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ活性大小：Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ(3)聚酰胺由酰胺聚合而成的高分子物质。吸附原理：利用分子内酰胺基和羰基,可与酚、酸、硝基化合物等形成氢键。吸附力与能形成氢键的基团有关。芳香核具有较多共轭键时,吸附力增大。吸附剂的活度氧化铝，硅胶的吸附力大小与其含水量有较大关系。活度级数含水量活度吸附能力小少大强大多小弱活化：105-110℃加热除水脱活：加一定水份降低活性4.流动相的选择流动相的要求

纯度高稳定对样品溶解度大粘度小

流动相的洗脱实质：流动相分子与被分离分子竞占吸附剂表面活性中心的过程。（1）被分离物质的极性与结构母核相同,取代基团极性愈大,分子极性愈大。母核相同,极性基团数目愈多,分子极性愈大。常见化合物极性：烷烃<烯烃<醚类<硝基化合物<二甲胺<脂类<酮类<醛类<硫醇<胺类<酰胺<醇类<酚类<羧酸类分子双键多,吸附力↑,共轭度↑,吸附性↑。空间排列,影响极性。流动相的选择空间排列,影响极性。氢键（2）吸附剂的活度（3）流动相：相似相溶原则常用流动相极性强弱顺序:

石油醚<环己烷<四氯化碳<苯<甲苯<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙醇<乙醇<甲醇<水（1）被分离物质的极性与结构流动相的选择物质极性吸附剂活度流动相极性大小大小大小吸附剂与流动相的选择己烷-苯极性递增苯-乙醚苯-乙酸乙酯氯仿-乙醚氯仿-乙酸乙酯氯仿-甲醇丙酮-水甲醇-水实验室中最常应用的混合溶剂洗脱用溶剂的极性宜逐步增加，跳跃不能太大。在以硅胶为固定相的吸附色谱中下列叙述正确的是（）A.组分的极性越强，吸附作用越强B.组分的分子量越大，越有利于吸附C.流动相的极性越强，溶质越容易被固定相所吸附D.二元混合溶剂中正己烷的含量越大，其洗脱能力越强思考题√√5.操作过程

吸附剂和洗脱剂的选择装柱与柱体老化进样洗脱流分收集与检测柱体拆卸与吸附剂回收一般为样品量的30～60倍。样品极性小、难以分离者，吸附剂用量可适当提高到样品量的100～200倍。柱色谱用的硅胶及氧化铝通常以100～200目或200～300目为宜，或甚至直接采用薄层色谱用规格。样品的预处理能直接溶于洗脱剂的样品：用适量洗脱剂溶解样品，尽可能少。不能溶解于洗脱剂的样品：用能使之溶解的溶剂溶解后，用少量吸附剂拌匀，挥尽溶剂，减压干燥、研粉。色谱柱常用玻璃柱。柱长为直径的10~20倍。柱子的大小按分离量选定。柱体高度应占柱管高度的3/4。柱子下端一砂芯过滤板，挡住填料不随溶剂流下去。也可用玻毛代替过滤板。下端的旋塞用于控制流速。砂芯过滤板往下到柱出口这一部分的体积越小越好，以减少柱外效应。柱口端可用一滴液漏斗滴加洗脱剂，也可以用一个蠕动的泵向柱子内按一定的流速输送洗脱液。A、柱子B、柱子的装填现在常用的方法是湿法装柱。即称取一定量的吸附剂，先倒入一定量的洗脱剂或比洗脱剂极性小的溶剂，搅拌均匀后，最好放在超声波震荡器中超声两分钟，以除去吸附剂内孔中的空气。然后在柱内装入2/3溶剂，打开活塞，让溶剂慢慢滴入锥形凭中，接着把这些悬浮液慢慢到入柱子中，并打开下部旋塞使多余的溶剂流出，最好一次到完，中间不停顿。吸附剂渐渐下沉到柱子底。倒完吸附剂后用手或带橡皮的玻璃棒轻轻敲打柱子并继续放出多余的溶剂，直到液面稍高于吸附剂顶为止。注意柱子顶部填料要平整，否则会使柱子效率下降。柱子内应无气泡，也无裂缝，否则要倒出重装。在以后的使用中柱子内溶剂要一直高于吸附剂表面。吸附剂的用量按样品分离量、分离难易的程度及填料的性能选择。分离1克样品约需要氧化铝20~50克，硅胶50~100克。C、上样上样方式一般有两种。一是样品溶解在少量有机溶剂中，然后把柱子液面放到正好与填料相平，将样品溶液缓缓沿破棒加入，不要使柱子填料被搅起，再将液面放到与填料面相平；就可以开始洗脱。第二种上样法是将样品溶于溶剂中，加入少许填料，将溶剂挥发干，在柱子的顶端留有一定的液体，倒入吸附了样品的填料后拨平，此时的液体应正好与固定相平或稍高出于一点。D、洗脱洗脱剂常用混合溶剂，一为极性溶剂，另一为非极性或弱极性。用调节两者比例的办法调节洗脱能力。洗脱有三种方法。一是等浓度洗脱，即自始至终采用同一种溶剂洗脱。二是脉冲洗脱，即采用几种不同洗脱强度的溶剂，依次从弱到强进行洗脱，用洗脱能力弱的先洗下吸附能力弱的物质，再改换溶剂，使洗脱能力增加，分段洗下吸附能力不同的物质。第三是用一定的装置进行梯度洗脱，先用弱洗脱能力，然后往里面逐步添加强洗脱剂，逐步增强洗脱能力，依次洗脱下不同吸附力的物质。洗脱液流速的大小视柱子体积而定。柱子大流速可放大。主要是保证样品在柱子中能得到充分的分离。E、接收与检测洗脱液用人工或用分部收集器分段接收。每份接收液的量视吸附剂用量多少而定。柱子体积大，每份接收的量也可大。收集液用薄层色谱、气相色谱或液相色谱等手段检测，相同组分的接收液进行合并收集。4干柱层析干柱层析是指在柱子内填充干的吸附剂进行分离的方法。干的柱层析的优点：①分离效果比柱色谱高，接近薄层色谱。②分离条件可用薄层色谱摸索，可照搬到干的柱层析中。③设备简单，消耗溶剂少，省工省时，一般在1小时以内可以完成分离。④操作方便。采用塑料薄膜柱，有色物质可以直接观察，有荧光或吸收紫外线的可以在紫外灯下观察，然后按分离带进行分段切开。⑤适用于制备性分离。其主要缺点：样品容量比湿装柱小，消耗吸附剂量大。另外，操作技术比湿装柱难，如操作不当，分离效果反而不如湿装柱。

二.干柱层析1.基本原理

干柱层析的原理与薄层层析相同，它是借颗粒间的孔隙所产生的毛细管作用而展开，由于干吸附剂颗粒的深孔内充满空气，在展开过程中，溶剂和样品分子很难进入颗粒的深孔，其吸附与解吸主要在吸附剂颗粒外部的表面进行。这样，就克服了样品分子由于进出吸附剂颗粒深孔所造成的扩散及分布（或传质）缓慢的缺点。因此，其柱效比湿装柱好。2.吸附剂

吸附剂是决定柱子效率的主要因素，它的粒度直径越小，直径范围越窄，装成的柱子分离越好，分离谱带窄而整齐。因此装柱前应将填料过筛。填料的粒度比常规柱色谱细，一般用200~300目，活度Ⅱ~Ⅲ级的硅胶吸附剂或活度Ⅲ~Ⅴ的氧化铝填料。应先加10%量的展开剂饱和，否则在展开过程中，溶剂前沿不整齐，影响层带分离。3.实验操作A．柱子及吸附剂的装填柱子常用尼龙材料制成的透明带子，可以透过柱子在紫外灯下观察荧光，也易于分离后切割分段。尼龙管一头扎死，塞进去一团棉花，在底部扎几个小孔排气。通过漏斗装入干吸附剂。装至柱高4/5处，并在桌子上礅紧，也可抓住一头，甩柱子借离心力装紧柱子。此外，也可以用玻璃或聚乙烯材料制作柱子。但玻璃管不易分割，并因玻璃吸收紫外线，各层带在柱上的位置不能用紫外光灯确定。柱子的长度取决于分离的难易，常用50cm长的柱子，难分离的样品要用70一106cm的柱子。样品与填料的比例一般为1：100~300。氧化铝用量较少，硅胶用量较多。成分简单的样品可以用较少的填料，成分复杂的样品要用较多的填料。B、加样及展开

柱子装好后开口朝上固定好，就可以加样了。加样方式仍然用溶液加样和拌样加样两种方法。溶液加样法较好。能溶解于展开剂的样品最好用展开剂溶解，样品溶液浓一些，加样后在填料上形成的吸附了样品的填料层薄一些对分离有利。加样后，上部填料应保持平整。否则影响层带的整齐。展开剂可以用在薄层色谱上探索条件时分离度最好的溶剂系统。展开时用滴液漏斗在柱填料上方往下滴溶剂，用活塞控制流速来控制展开速度。当展开剂展到柱底，展开就告结束。C、定位及分割由于干柱层析是溶剂在毛细作用及重力作用下向下移动作层析展开，柱内是干吸附剂，不会有液流的涡流形成，因此色带明显而整齐。有色物质可直接看到。在紫外灯下发荧光的物质可在紫外灯下定位。吸收紫外光的物质可用带荧光粉的硅胶作填料，用不吸收紫外光的溶剂展开，在紫外灯下观察定位。其他物质可以按薄层色谱的比移值推算定位，或者分成若干段萃取后检测。用刀子按定位切成若干段，每两个物质之间的一定长度的填料可以不收集，以防止杂质混入纯品。然后萃取每一个物质，浓缩并检验纯度。1.原理

TLC特点

快速；灵敏高选择；显色方便利用吸附剂对不同组分的吸附能力不同，展开剂对各组分的溶解与解吸能力也不相同，各组分不断地被吸附、解吸附……产生差速迁移。2.参数

比移值

(retardationfactor，Rf

)0≤Rf

≤1Rf

可用范围：0.2-0.8Rf

最佳范围：0.3-0.5分离物质性质薄层板性质展开剂极性温度展开剂蒸气饱和程度

3.Rf

影响因素（2）分离参数

分离度(resolution;R)（1）定性参数－比移值Rf

例：在薄层板上分离A、B两组分的混合物，当原点至溶剂前沿距离为16.0cm时，两斑点质量重心至原点的距离分别为6.9cm和5.6cm，斑点直径分别为0.83cm和0.57cm。求两组分的分离度及Rf值。解：硅胶G硅胶+煅石膏硅胶H硅胶（不含黏合剂）硅胶HF254硅胶H+荧光物质硅胶GF254硅胶G+荧光物质（3）固定相吸附柱色谱的固定相薄层色谱也可以使用,但薄层色谱所用的硅胶、Al2O3粒度比柱色谱更细。硅胶：40

m,200目左右

薄层板的铺制常用平滑玻璃板软板：吸附剂直接铺涂。缺点：风吹即飞。目前很少使用。硬板：吸附剂＋黏合剂→糊状→铺板→晾干→活化粘合剂：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）活化：晾干的板在110℃活化1h，置于干燥器中备用。（4）

展开剂选择物质极性吸附力流动相极性防止大强大Rf太小小弱小Rf太大

分离强极性物质，选择强极性展开剂，同时也应考虑固定相的活性。分离混合样品时，先用单一中等极性展开剂尝试，再摸索二元展开剂。某些溶剂的极性的强弱弱单一溶剂混合溶剂极性石油醚苯:乙酸乙酯（50:50）

弱强环己烷氯仿:乙醚（60:40）四氯化碳环己烷:乙酸乙酯（20:80）甲苯氯仿:甲醇（95:5）苯氯仿:

丙酮（70:30）乙醚苯:乙酸乙酯（30:70）氯仿苯:乙醚（10:90）乙酸乙酯乙醚:甲醇（99:1）丙酮乙醚:二甲基甲酰胺（99:1）乙醇乙酸乙酯:甲醇（99:1）甲醇苯:

丙酮（50:50）水氯仿:甲醇（90:10）吡啶醋酸展开剂Rf（A）Rf（B）分离效果苯0.450.42分不开苯+甲醇0.380.52分开例：A，B两组分的试样问：A、B哪个组分的极性大答：B的极性大。展开剂极性增大，极性大的Rf值增大。（5）点样与展开

点样量一般1-几十μg，φ2-3mm点样量太大易拖尾点样位置：距底边1.5-2cm

点样展开

先饱和15-20min，防止边缘效应展开剂浸薄层板下端0.5cm，不能浸住起始线层析缸应密闭展开方式：单向展开，双向展开……本身有色显色剂紫外灯下显色荧光薄层板有紫外吸收物质日光下黑色

碘硫酸茚三酮荧光物质紫外吸收物质显色（6）定性与定量显色①物理显色

紫外光：254nm与365nm碘：碘是一种非破坏性显色剂，它能检出的化合物很多，价廉易得，显色迅速、灵敏。它的最大特点是与物质的反应往往是可逆的，当化合物定位以后在空气中放置时，碘即升华挥去，可以回到组分的原来状态，有利于薄层的进一步处理。

②化学显色

化学显色对显色剂一般有以下几点基本要求：背景与斑点的颜色需形成鲜明对比；要能在纸或薄层上显出一个轮廓清晰的斑点，斑点应不扩散；显出的颜色有足够的稳定性；反应灵敏，能使微量组分显出颜色。定性分析：比较组分与对照品Rf

值对未知样品，要几个展开体系均有一致Rf值，或双向展开法确认。定量分析洗脱法薄层扫描目视比色比较色斑大小、深浅。误差大，±10-30％.刮下溶解光度法测±5%误差<5%4.吸附力的规律性能在吸附剂和吸附分子间形成氢键时，吸附力就大。被吸附分子的极性大，吸附力就大；分子中极性官能团增多，吸附力也增加。分子中有双键时吸附力比无双键时大，双键增大，特别是形成共轭时吸附力增大的更明显。苯环的影响比双键大。同系物中分子量大则吸附作用也强。同分异构体若形成了分子内氢键，则对吸附剂的吸附力大大减小。含单官能团的化合物，当烷基链长短相同时，吸附力大小为：羧酸

醇、酰胺

伯胺

酯、醛酮

腈、叔胺、硝基化合物

醚

烯

卤代烷

烷5.操作注意事项①层析缸的密闭②层析缸的饱和③展开距离④层析缸的放置：展开时应将层析缸放在水平、稳定的实验台上，要避免阳光直射，对遇光易分解的化合物，应将层析缸放置暗处或覆盖黑纸。例：生物碱薄层色谱的定性分析

1．展开剂2．吸附剂3．显色剂4.对照品定性分析（化学对照品、对照药材、阴性对照）5．以Rf值为基准定性分析（边缘效应及其它影响因素）6．薄层扫描定性分析（薄层指纹图谱）

纸上色谱法是分配色谱法中较常用的。最简单操作之一是取一条滤纸，悬挂在一个支架上，使它的底端浸入一盛有溶剂的浅皿中。在纸下端刚好高出液面部分用毛细管滴上一滴试液。将支架置于密闭容器内，使纸周围为溶剂蒸汽所饱和，静置数小时，在这期间，溶剂由于纸上毛细管作用而沿滤纸上升。当溶剂前沿升到快近纸条上端时，取下滤纸使之干燥。如果试液中的化合物是有颜色的，则纸上会显出各组分斑点。较常见的情况是，层析的化合物是无色的，那么，待纸干燥后，于纸上喷以显色剂而使化合物斑点显色。上法为上行纸上色谱法。四、纸色谱法1.基本原理分配色谱载体滤纸的纸纤维固定相滤纸上吸附的水流动相与水不相混溶的有机溶剂操作类似于薄层色谱法，但原理不同定性参数RfRf物质极性极性大，Rf小极性小，Rf大展开剂极性