第二章基因工程基本原理课件

D基因工程的支撑技术第二章基因工程的基本原理C基因工程的基本原理B基因工程的分子生物学A重组DNA技术的理论基础第一节基因工程的基本原理A重组DNA技术的理论基础基因工程的基本原理19世纪中孟德尔

豌豆杂交试验

遗传因子经典遗传学20世纪初摩尔根

果蝇杂交实验

基因基因学1944年艾弗瑞

肺炎双球菌转化实验

遗传物质DNA1973年伯格-杰克森-考恩-鲍耶

DNA分子体外拼接分子遗传学1953年沃森-克瑞克

DNA双螺旋结构分子生物学基因工程B基因的分子生物学基因工程的基本原理C基因工程的基本原理基因工程的基本原理提高外源基因的剂量——分子遗传学原理筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如：启动子、

增强子、操作子、终止子、上游调控序列等列、mRNA非编码区、密码子等——分子生物学原理

修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：SD序

基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产——生化工程学原理

——分子生物学原理

D基因工程的支撑技术基因工程的基本原理核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交技术细菌转化转染技术DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应（PCR）技术

2.1

核酸的结构与功能2.2

基因与基因组2.3

中心法则与基因表达调控2.4

自然界的基因转移和重组第二节基因工程的分子生物学基础

2.1

核酸的结构与功能核酸：就是由许多核苷酸按照一定的顺序连接所组成的多核苷酸，它的主要功能是充当遗传信息的载体。

脱氧核糖核酸:DNA

核糖核酸:RNA戊糖碱基核苷酸的基本组成DNA的一级结构与功能结构式DNA的结构和功能DNA的二级结构与功能1螺旋直径2nm2链间有螺旋形凹槽，较小的为小沟（1.2

nm），较大的为大沟（2.2nm）3碱基间距为0.34nm4结构重复周期3.4nm5每轮碱基数为106碱基平面与纵轴垂直。

RNA的结构与功能

信使RNA（messenger

RNA，mRNA）核糖体RNA（ribosomal

RNA，rRNA）转运RNA（transfer

RNA，tRNA）mRNA1.mRNA的转录和翻译发生在同一个细胞空间，这两个过程几乎是同步进行的。2.半衰期短。3.许多原核生物mRNA以多顺反子的形式存在。4.原核生物mRNA的5’端无帽子结构，3’端没有或只有较短的多聚（A）结构。5.原核生物常以AUG（有时GUG，甚至UUG）作为起始密码子

真核细胞mRNA的合成和功能表达发生在不同的空间和时间范畴内。

单顺反子形式存在。5’端存在“帽子”结构。绝大多数具有多聚(A)尾巴。真核生物几乎永远以AUG作为起始密码子。

rRNA49种蛋白质60S亚基28S

rRNA5.8S

rRNA5S

rRNA40S亚基18S

rRNA33种蛋白质50S亚基23S

rRNA5S

rRNA36种蛋白质30S亚基16s

rRNA21种蛋白质高等动物核糖体（80S）E.coli核糖体（70S）tRNA二级结构

三级结构

核酸的理化性质及其应用

一般理化性质

DNA为白色纤维状固体

RNA为白色粉末状固体

紫外吸收：260nmA260/

A280值可以反映核酸的纯度。纯的DNA：A260/

A280

=1.8纯的RNA：A260/

A280

=2.0DNA变性

在某些理化因素下，DNA分子互补碱基之间的氢键断裂，致使DNA双螺旋结构松开，变成单链，即为DNA变性（denaturation）。引起变性的因素有：加热、酸碱、尿素、甲醛等。

核酸变性后，在260nm处的吸收值上升，这叫增色效

应(hyperchromic

effect)。增色效应常可用来衡量DNA变性的程度。核酸的理化性质

热变性中光吸收达到最大吸收（完全变性）一半（双螺旋结构失去一半）时的温度称为DNA的熔点或熔解温度（Tm）。DNA变性热变性曲线(熔解曲线)在DNA发生热变性的过程中，A260随温度的变化曲线影响Tm值的因素?

变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复为天然的双螺旋结构，这种现象称为复性（renaturation）。DNA单链之间、一条DNA和一条RNA链之间主要存在序列互补配对区域，不管是整条链互补，还是部分序列互补，均可能重新形成整条双链或部分双链，这即为核酸分子杂交（hybridization）。复性和杂交

2.2

基因与基因组基因的结构基因（gene）：能够编码一段多肽或功能RNA的一段核苷酸序列。基因的基本特性：基因可自我复制基因决定性状基因可以突变基因的分类：结构基因调控基因

原核生物基因结构

——

操纵子(operon)

机制

其他调节序列

编码序列(promoter)

操纵序列(operator)

启动序列

真核生物基因结构

真核生物的结构基因不仅在两侧有非编码区，而且在基因内部也有许多不编码蛋白质的间隔序列，即内含子（intron），编码区则成为外显子（exon）。终止子（terminator）基因结构中能够促进转录终止的DNA序列，在RNA水平上通过转录出的终止子序列形成茎环结构而终止。

基因组

原核生物的基因组基因组小多顺反子mRNA非编码区少基因重叠不含内含子基因组（genome）：单倍体细胞中的全套染色体上所有基因的总和。真核生物基因组同源基因组基因组大单顺反子重复序列非编码序列90%以上基因家族转座子/逆转座子

2.3

中心法则与基因表达调控

生物信息的传递原核生物基因的表达调控真核生物基因的表达调控2.3.1

生物信息的传递•复制的起始(initiation)•DNA链的延伸(elongation)•复制的终止(termination)DNA复制的基本过程转录的基本过程

模板识别(TemplateRecognition)

转录起始(Initiation)

转录的延伸(Elongation)

转录的终止

(Termination)蛋白质的生物合成•••••氨基酸活化肽链的起始肽链的延伸肽链的终止新合成多肽链的折叠和加工

转录水平上的调控mRNA加工成熟水平上的调控翻译水平上的调控2.3.2

基因的表达调控32lacI调节基因lacZlacYlacADNAmRNAβ

-GalactosidasePermeaseTransacetylaseProtein结构基因PlacIPlacOlacTheLACoperon原核生物基因的表达调控①阻遏蛋白的负调控调控基因②CAP正调控真核生物基因的表达调控DNA水平的调控转录水平的调控(transcriptional

regulation)转录后水平的调控(post

transcriptional

regulation)翻译水平的调控(translational

regulation)翻译后水平的调控(protein

maturation)真核生物基因表达调控的特点和种类真核生物DNA水平上的基因表达调控

真核生物转录水平上的基因表达调控顺式作用元件和反式作用因子真核基因他水平上的调控

RNA的加工成熟、翻译水平的调控、翻译后水平的调控基因丢失基因扩增基因重排DNA甲基化状态与调控染色质结构与调控DNaseI超敏感位点基因座控制区（LCR）核基质结合区（MAR）

2.4

自然界的基因转移和重组接合作用

细菌之间通过菌毛相互接触时，质粒便可从一个细胞转移至另一细胞，这种类型的DNA转移称为接合作用（conjugation）

。

转化作用（transfromation）通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。转导作用（transduction）当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组方式。转化及转导溶菌途径溶源途径噬菌体感染宿主的结果:第三节基因工程的支撑技术核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交技术细菌转化转染技术DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应（PCR）技术基本原理

(PCR—PolymeraseChainReaction聚合酶链式反应)

一个DNA经n次扩增后,一个DNA分子可变为2n个分子DNA扩增需要对待扩增的DNA序列有所了解，至少要对其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物。PCR技术反应体系DNA模板；dNTPs；+Tris·HCl缓冲液；引物；DNA聚合酶循环90℃变性30″；50℃退火30″；75℃延伸1′；进入第N次循环。PCR原理示意图锚定PCR（AnchoredPCR，A-PCR）或称RACEPCR种类反向PCR（inversePCR）

该法可用于扩增已知序列两侧的未知序列反转录PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)

主要用于mRNA的PCR扩增RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time

PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative

PCR)或者RTQ-PCR(real-time

quantitative

PCR)。实时PCR(real-time

PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。定量PCR（Q-PCR）还有半定量semiquantitative

PCR。real

time

PCR

的定量使用萤光色素，目前有二种方法。一种是在ds

DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。实时荧光定量PCR（Real-timePCR）荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR荧光染料：加端PCR（Add-onPCR）在合成引物时加上研究者所需要的核苷酸序列：如某种限制酶的识别序列，某一基因的调控或其它必需序列错配PCR（mismatchedPCR)利用该法可在一已知DNA序列中引起点突变，缺失突变和插入突变。重组PCR（RecombinantPCR）利用该法可将不同基因的DNA片段连接在一起。分子杂交技术按其分子种类划分DNA杂交

探针为DNA或RNA

RNA杂交

探针为DNA或cDNA蛋白质免疫分析

探针为抗体原位杂交(insituhybridization)

i.原位菌落杂交

ii.原位噬菌斑杂交

iii.原位细胞杂交

iv.原位组织块杂交斑点杂交(dothybridization)

先分离DNA，RNA或蛋白质，然后将样品液直接点在固体基质上进行杂交，不能测定分子量大小。按其样品制备划分转移杂交或印迹杂交(blottinghybridization)

先纯化样品，然后使不同大小的分子在凝胶上分离，转移到固体基质上，与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子的分子量。用于转移的方法有：

i.扩散法

ii.毛细管法

iii.电泳转移法

iv.真空转移法夹心杂交法(sandwichhybridization)它利用两种探针与待测DNA结合，先将不带标记的探针固定在基质上，然后用待测样品与之杂交，洗去非特异性结合后，再与第二种带标记的探针杂交。这种方法可用于粗制DNA样品，可检测出0.2ng的DNA样品分子杂交的一般程序DNA和RNA的杂交

制备DNA或RNA样品；与固定基质结合；80℃真空固定；预杂交；加入标记探针杂交；洗涤；放射自显影或显色反应。

蛋白质的免疫分析制备蛋白质样品与固定基质结合；常温空气中固定；封闭剂封闭；一抗反应；洗涤；二抗-酶偶联物反应；洗涤；显色反应（EIA）；或→一抗放射标记物→洗涤→放射自显影（RIA）探针的制备32P，3H，35S 用于核酸标记，其中32P和35S使用频率高。32P标记核苷酸的α位或γ位，35S则是标记核苷酸的α位；125I，3H，14C用于蛋白质标记。放射性同位素标记物非放射性标记物半抗原包括地高辛配体，汞，2-乙酰胺二苯丙茂和金属铕。地高辛配体是一种脂质半抗原，可将其连在dUTP上，然后用酶将其掺入新合成链中。检测上述标记物的方法是利用二抗-酶偶联物反应和显色反应。生物素核酸探针是与基因部分互补的一短的DNA或RNA碱基序列，核酸探针可以与基因杂交。标记探针的制备链标记法

i.切口移位法

ds-DNA+DNaseI+DNApolI+dNTP(32P-dCTP)ii.随机