微生物检测仪器讲稿

亲爱的同学们大家下午好！!我们又见面了，还记得我吗？我来自金域检验微生物室。我叫张磊。10月和大家一起学习过离心机显微镜和生物安全柜。今天下午接下来2节课要讲的内容是：第十章临床微生物检测仪器。本章节需要重点掌握的内容是微生物自动化检测仪器的工作原理，也是本章的难点内容。仪器的基本结构与功能的内容要求熟悉，仪器的常见故障及维护要求了解。第一节课先讲概述和自动血培养系统，第二节课讲自动微生物鉴定和药敏系统以及最后做一个小结。通过第一节课的学习，希望同学们能够回答以上思考题。请同学们记录一下。5分钟时间。微生物学自动化检测系统是随着化学、计算机学、微电子学、分子生物学、物理学等学科的飞速发展，并向微生物学渗透、交叉，应用于临床微生物的实际检测工作中，而出现的各种自动化检测系统。那么这些自动化检测系统根据功能可分为两类：一类是自动血培养系统，一类是自动微生物鉴定及药敏分析系统。自动血培养系统的功能是用来检测注入到这些培养瓶内的标本是否有微生物生长。标本通常是血液，当然也可以是其他无菌体液比如胸水腹水等。仪器通过自动的连续监测，能够识别因微生物生长代谢而导致的生长指数改变，随之仪器自动报警提示有细菌生长。简单来说它的功能就是检测是否有微生物生长。自动微生物鉴定及药敏分析系统的功能是将培养基上分离到的可疑菌落制成纯的菌悬液，放入仪器中，经过仪器一系列处理最后自动得出鉴定及药敏结果。简单来说它的功能就是进行鉴定及药敏试验。自动化血培养系统包括这五点内容，其中工作原理是需要重点掌握的内容。现在我们开始学习自动血培养系统。自动血培养系统由计算机控制，对血培养瓶实施连续、无损伤瓶外监测。那么如何实现无损伤瓶外监测呢？我们先了解一下什么叫做有损伤，在没有自动仪器的情况下，只有这个血培养瓶，则需要使用无菌注射器穿刺把培养瓶内液体抽取出来进行显微镜观察并接种到固体培养基上来观察是否有细菌生长。这就是有损伤了。而无损伤瓶外监测就是不需要把瓶内培养液抽取出来，仪器直接在瓶外进行监测。如何实现呢？自动血培养仪的工作原理可以回答这个问题。首先抽取患者标本注入培养瓶中，然后放入仪器内，如果有微生物生长，会导致培养液的混浊度、PH值、CO2的浓度、荧光标记底物、代谢产物等发生改变，这些都可作为微生物生长代谢的指标。仪器通过自动监测这些指标，可以定性地检测微生物的存在。根据检测原理也就是监测的指标不同可分为三大类：分别是以检测培养基导电性和电压力为基础的血培养系统、应用测压原理的血培养系统、采用光电原理监测的血培养系统。目前临床应用最广泛的是测压原理的系统和光电原理的系统。检测培养基导电性和电压力为基础的血培养系统工作原理：是根据血培养基中因含有不同电解质而具有一定导电性，微生物在生长代谢的过程中可产生质子、电子和各种带电荷的原子团，使培养基的电压发生改变，通过电极检测培养基的导电性或电压的变化可判断有无微生物生长。这种血培养系统在国内非常少见。应用测压原理的血培养系统的工作原理是：许多细菌生长过程中，常常伴有吸收气体或产生气体现象，如很多需氧菌在胰酶消化大豆肉汤中生长时，由于消耗培养瓶中的氧气，故首先表现为吸收气体。而厌氧菌生长时最初均无吸收气体现象，仅表现为产生气体（主要为CO2）。密闭的培养瓶内发生了气体的吸收或产生，会导致瓶内压力的改变，因此可利用监测培养瓶内压力的改变来检测微生物的生长情况。目前临床常用的测压原理的系统有：VERSATREK系统，仪器检测气体的消耗主要是O2，以及气体的产生主要是CO2、N2、H2。其特点是培养瓶顶部需要连接一个连接器，以及培养瓶内的磁力搅拌子。走下去学生中间，展示磁力搅拌子。那么，他们是如何工作的呢？培养瓶顶部的连接装置与仪器的感压探测器相接，由探测器每12/24分钟监测培养瓶顶部气体压力变化。气体压力数据传到计算机，由计算机软件以气体压力对时间的变化绘制成生长曲线图，由此判断是否有微生物生长。有菌生长时指示灯变红。磁力搅拌子，也就是瓶内有一根小磁棒，瓶子放入仪器的瓶孔位置后，在磁场作用下磁棒会旋转起来，使培养液呈旋涡状搅动，以达到振荡培养的目的，振荡的目的是为了使标本与培养液充分混匀并通气，促进需氧菌生长。需氧瓶内有，厌氧瓶内无搅拌子。采用光电原理监测的血培养系统：微生物在代谢过程中必然会产生终代谢产物CO2，引起培养基pH及氧化还原电位改变。利用光电比色检测血培养瓶中某些代谢产物量的改变，可判断有无微生物生长。目前临床常用的采用光电原理监测的血培养系统有：梅里埃公司的BacT/Alert系统和BD公司的Bactec9000系列系统。今天就这两个系统举例说明它们的工作原理。这是一台BacT/Alert系统，先看一段这个系统工作原理的视频。该系统在每个培养瓶底部装置一带含水指示剂的CO2感受器，感受器与瓶内液体培养基之间由一层仅允许CO2通过的离子排斥膜相隔，培养基中的其他成分包括氢离子均不能通过离子排斥膜。当微生物生长时，其释放出的CO2可渗透至感受器，并与感受器指示剂上饱和水发生化学反应，产生游离氢离子使PH值降低，感受器上的指示剂溴麝香草酚蓝由绿变黄。发光二级管（LED，LightEmittingDiode）将光投射到感受器上，再由一个光电探测器每10分钟测量其产生的反射光，颜色由绿变黄，反射光强度增强。计算机自动连续记忆反射光强度并绘制成生长曲线图，由此确定是否有微生物生长。我们再来看看这两只培养瓶的底部，同学们能分辨出哪个是阳性瓶哪个是阴性瓶吗？接下来我们再来看BD公司的Bactec系列系统的工作原理。培养瓶的底部的感受器含有荧光感应物质，当培养瓶中有微生物生长时，产生的CO2可与培养瓶底部感受器中的水发生反应产生H+，使PH降低，酸性环境促使感受器释放出荧光物质。发光二级管发射的光激发荧光感受器而产生荧光，光电感受器每10分钟对荧光强度进行检测，检测数据传送到计算机后，根据荧光的线性增加和荧光产量增加等绘制生长曲线，由此分析微生物的生长情况。这是一个典型的阳性曲线图，横座标是时间，纵座标是荧光强度，随着时间的推移，荧光强度增强，达到阈值仪器报警阳性。这是BD公司的Bactec9120系统和Bactec及FX系统。这是配套的培养瓶，荧光的改变肉眼观察不到，因此与刚刚颜色改变不同，这个瓶底部阴性和阳性肉眼观察不到。我们用一张表来总结一下目前三种临床常用的连续监测血培养系统的工作原理。自动血培养系统由培养瓶、培养仪、数据管理系统三部分组成。培养瓶的种类通常有：需氧培养瓶、厌氧培养瓶、小儿培养瓶、分枝杆菌瓶、其他。临床常见2种血培养系统血培养瓶的共同点与不同点。培养仪的组成包括：恒温装置、振荡培养装置、监测装置，以BacT/Alert系统为例。恒温装置：培养瓶放入孵育箱后进行恒温培养，不同血培养系统的孵育箱能装载培养瓶的数量有所不同，一般为数十至数百。振荡培养装置：培养瓶放入孵育箱后进行振荡培养，使培养液与标本充分混合并通气。监测装置：自动连续监测并将数据传送至数据管理系统，一旦分析显示某一培养瓶达到阳性判断标准时，培养仪将会给予提示信息。数据管理系统包括：主机、监视器、键盘、条码阅读器、打印机等相当于一个小型的信息管理系统，收集并分析来自仪器的数据，并将患者和培养瓶的资料存入数据库存，数据库可保存大量的信息同，供用户查询、分析结果、还可以根据需要出具工作量报告。自动血培养系统的性能特点：1、培养基营养丰富、2、以连续、恒温、振荡方式培养3、培养瓶多采用不易碎材料制成4、采用封闭式非侵入性的瓶外监测方式5、自动连续监测6、阳性结果报告及时7、培养瓶多采用双条形码技术8、培养瓶可随时放入培养系统，并进行追踪检测9、数据处理功能较强10、设有内部质控系统11、检测范围广泛：自动血培养仪常见故障及维护，举4个常见例子。仪器报警提示温度异常（过高或过低），：多数情况下是由于仪器门打开的次数太多引起，需注意尽量减少仪器门开关次数，并确保培养过程中仪器门是紧闭的。通常培养仪的门要关闭30min后才能保持温度平衡。瓶孔被污染如果培养仪瓶孔内的培养瓶破裂或泄漏，需按各仪器要求及时进行清洁和消毒处理。数据管理系统与培养仪失去信息联系或不工作：此类故障只可能在微机与培养仪仪器相对独立的系统中出现。此时培养仪仍可监测标本，但它只能保留最后72小时的数据，检测时也只能打印阳性或阴性标本的位置。因此必须注意放置培养瓶时，需先扫描条形码，再将它放入启用的瓶孔内。仪器对测试中的培养瓶出现异常反应：在BACTEC9050培养仪中，出现此类故障的原因大多是由于培养瓶未经扫描条形码就放入仪器内，或虽已扫描，但未放入规定的瓶孔中，系统将这些培养瓶归为“匿名瓶”，在显示屏上会出现提示信息。此时应将“匿名瓶”取出，重新扫描后放入。血培养系统的进展：检出的范围更广,阳性率更高；灵敏度更高，污染率、假阳性率和假阴性率应降至最低；自动化和计算机的智能化程度更强；体积更小，仅需极微量的血液样品即可检出所有的微生物；检验周期更短，工作效率更高；成本更低，结果报告更快；使血培养检查更容易被患者接受。第二节课接下来讲本章第二部分内容：微生物自动鉴定及药敏分析系统，包括5个内容，其中工作原理要求重点掌握。通过第二节课的学习希望同学们能够回答这些思考题，请同学们记录一下，3分钟时间。传统的细菌鉴定通常是根据平板上生长的菌落的菌落形态、辅以革兰染色、生化反应，生化反应包括触酶、氧化酶等等一系列复杂的试验。最后由微生物工作人员通过查阅工具书及个人经验综合分析判断将细菌到属或种的水平。传统的微生物学鉴定方法，过程烦琐，费时费力，质量控制难，易发生主观片面错误。如何做到快速、准确、简易和自动化？现在使用的自动鉴定及药敏设备已经可以做到。微生物自动鉴定及药敏分析系统大多是采用数码鉴定原理。数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。基本原理是计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。这样讲可能有点不好理解，我们来看看实例。以梅里埃API鉴定系统为例，这里每个小管都代表一个生化反应试验，每3个测定为一组，每个以1、2和4标记，在每组中，阳性的小管以相应的数字相加，得了一个值，把这些生化反应的结果按这个规则转换成数学模式，每种细菌的生化反应模式通过转换都会得出一组数码，如1154575。用大量的已知菌来进行这些生化反应试验建立数据库或编成检索本，未知菌经过生化反应得出的数字编码通过查阅检索数据库可得出结果。API鉴定系统是一个半自动的系统，接种需要人工进行。VITEK2compact鉴定及药敏系统是一个比API鉴定系统自动化程度更高的系统，预先调好菌悬液，仪器可自动接种自动判读并自动得出鉴定结果。抗菌药物敏感性试验的检测原理：其实质是微型化的肉汤稀释试验。将抗菌药物微量稀释在条孔或条板中，加入菌悬液孵育后放入仪器或在仪器中直接孵育，仪器每隔一定时间自动测定细菌生长的浊度，或测定培养基中荧光指示剂的强度或荧光原性物质的水解，观察细菌的生长情况。得出待检菌在各药物浓度的生长斜率，经回归分析得到最低抑菌浓度MIC值，并根据CLSI（Clinicalandlaboratorystandardsinstitute,临床与实验室标准委员会）标准得到相应敏感度：敏感“S（susceptible)”，中介“I(intermediate)”，耐药“R（resistant)”。这样讲可能也有点不好理解，我们再来看看实例。以梅里埃公司的ATB药敏试验为例，抗菌药物微量稀释在条孔中，这里有5种药物，每种药物都有多个药物浓度，如第一组药物有8个浓度，0.5、1、2、4、8、16、32、64mg/L，倍比的浓度梯度。每个小孔加入菌悬液经过孵育后，通过观察细菌的生长情况，可得出最低抑菌浓度MIC值。这个是通过观察混浊度，细菌生长液体变浊说明该孔药物浓度不能抑制目的菌，第一个孔的MIC值是多少呢？是8。这也是个半自动的系统，同样是接种需要人工进行。判读可以人工也可以仪器。VITEK2compact是相比ATB系统自动化程度更高的系统。可以自动接种自动连续监测以判读生长情况，比肉眼观察更准确。微生物自动鉴定及药敏分析系统一般包括4个基本结构，（1）测试卡（板）（2）菌液接种器（3）培养和监测系统（4）数据管理系统不同的测试卡有不同的功能，最基本的测试卡（板）包括：分为鉴定卡和药敏卡，鉴定卡又分为革兰氏阳性菌鉴定卡（板）、革兰氏阴性菌鉴定卡（板），药敏卡又分为革兰氏阳性菌药敏试验卡（板）、革兰氏阴性菌药敏试验卡（板）常规鉴定卡使用比色法原理根据颜色变化来判定各项生化反应结果的阴阳性，快速荧光鉴定卡是使用荧光法根据荧光强度变化来判定各项生化反应结果的阴阳性，最后得出鉴定结果。常规药敏卡原理是比浊法，浊度增加提示细菌生长。快速荧光药敏卡原理是荧光法，荧光增强提示细菌生长。绝大多数自动微生物鉴定及药敏分析系统都配有自动接种器，大致可分为真空接种器和活塞接种器，以真空接种器较为常用。仪器一般都配有标准麦氏浓度比浊仪，操作时只需稀释好的菌液放入比浊仪中确定浓度即可。培养系统：孵育箱保持温度恒定。监测系统：每隔一定时间对每孔的透光度或荧光物质的变化进行检测。数据管理系统：系统的神经中枢，始终保持与孵箱/读数器、打印机的联络，控制孵箱温度，自动定时读数，负责数据的转换及分析处理。1、自动化程度