治疗用蛋白药物的研发现状与展望

治疗用蛋白药物的研发现状与展望

在各种疾病的治疗过程中，小分子药物几乎无法模拟复杂而微妙的蛋白质相互作用机制。只有具有高目标特异性和亲和力的蛋白质药物才能发挥作用。根据其药理学活性,治疗性蛋白药物主要可分为以下几类:(1)替代疗法,针对由于遗传病、生理或病理性代谢异常造成的缺乏。(2)加强现有的细胞和生理系统途径,以抵抗某种异常。(3)提供人体没有的新功能或活性机制。(4)干扰或拮抗人体与疾病相关的某种分子或组织。(5)作为靶向载体携带治疗分子。蛋白药物的分子类型主要包括单抗、细胞因子以及激素和酶类等。目前全球已经有300多个蛋白质药物品种上市,FDA批准了共140种蛋白质药物,总销售额超过500亿美金,还有200多个重组蛋白质药物处在研发的各个不同阶段。截至2013年,全球处方药市场销售前50名中22个是生物技术产品,世界前20位畅销药中有9个是重组蛋白药物。虽然蛋白药物在细胞水平和胞外生理系统水平疾病治疗机制中有着无可替代的优势,但蛋白质在分子性质上其实并不是理想的药物候选物。首先,作为功能和结构高度相关的复杂大分子,蛋白质药物稳定性较差,如容易形成蛋白聚体、氨基酸侧链异质化、可溶性低等,使其生产和贮存难度很大;其次,蛋白药物容易通过各种清除途径被人体内的蛋白酶降解,体内半衰期较短,为了维持其疗效临床应用中需要频繁给药,患者的依从性较差;再者,所有的蛋白药物对于病人来说都有潜在的免疫原性问题,抗体的产生是一个主要的安全性问题,并导致药效的降低。由于很多以延长药物半衰期为目的的策略,同时能够提高蛋白药物稳定性并减少免疫原性。因此,通过蛋白优化设计和工程改造获得长效蛋白药物是提高重组蛋白成药性的重要策略,已成为当今蛋白新药研发的重点方向和高热度领域。蛋白药物的体内清除机制包括肾小球过滤清除、外周血介导的蛋白降解清除、肝脏清除、血浆蛋白酶降解、及受体介导的内吞清除作用等,通常一种蛋白的体内代谢包含一种以上的清除机制。在肾小球滤过屏障(glomerularfiltrationbarrier,GBM)作用下,低于50kDa的小相对分子质量蛋白能够通过肾小球过滤和降解快速清除,与此同时,内皮细胞的蛋白多糖和GBM形成阴离子屏障,能够阻碍带负电荷的蛋白分子通过;另外,血清蛋白能够依靠外来因子的电荷和表面性质,经范德华力、离子相互作用或疏水作用与其发生作用,并会导致随后在脾、肝、肺等部位通过网状内皮组织(reticuloendothlialsystem,RES)摄取而清除,对于相对分子质量较大等不能通过肾小球过滤的蛋白,肝胆管清除、血清蛋白介导RES清除机制成为主要清除途径;受体介导的细胞内吞、溶酶体降解作用也是蛋白清除的重要途径,但在这种机制中,一些血浆蛋白如血清白蛋白、IgG等,能够通过新生儿Fc受体(FcRn)介导的再循环机制,逃避内吞进入溶酶体降解,从而具有较长的半衰期;对于某些免疫原性比较强的蛋白质药物,能够通过抗原递呈激发免疫系统形成免疫复合物而快速清除;最后,由于血浆蛋白酶的广泛存在,许多蛋白质最终被降解而清除。因此,针对这些体内清除途径,可以通过提高蛋白流体力学半径、增加分子量、调整蛋白理化性质,以及和血清白蛋白、IgG融合等方式延长蛋白血浆半衰期,本文对这几个方面的蛋白修饰和工程化技术进行综述。1peg修饰蛋白药物聚乙二醇[poly(ethyleneglycol)]是一类聚醚类聚合物,具有高度的亲水性以及免疫学惰性,是经美国食品药品监督管理局(FDA)批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。聚乙二醇修饰又称分子的PEG化(pegylation),即将活化的聚乙二醇与蛋白质分子相偶联。由于PEG独特的理化特性,如较低的相对分子质量多分散性、良好的水相和有机溶剂可溶性,其得到广泛应用。蛋白经PEG修饰后,PEG中每个乙氧基单位可以结合2~3个水分子,可将球形修饰蛋白的表观相对分子质量提高5~10倍,大大提高水化半径。这种流体力学体积增加的PEG化蛋白能够显著减少肾小球过滤引导的快速清除水平并改变生物分布;可减少电荷密度、提供空间位阻,使血清蛋白难以接近,从而大大降低RES清除;可以屏蔽抗原决定簇,降低免疫系统识别作用;这种位阻效应还可以在体内阻止蛋白水解酶的降解。此外,水合状态能够增强产品的溶解性、由于PEG化表面的相斥作用降低聚体形成从而提高蛋白的热稳定性。PEG化蛋白药物可按照PEG本身的分子形式或偶联的方式不同进行分类,根据PEG结构可分为线性、支链两种修饰方式,根据PEG与蛋白质分子上的极性氨基酸残基偶联方式可分为:巯基、氨基、羧基、羟基修饰。早期开发上市的PEG化蛋白药物由于偶联技术的限制,多以随机修饰为主;而近几年来,出于对工艺控制、质量表征以及药物本身有效性、安全性的考虑,各种定点修饰技术受到各药物研发机构的亲睐。如Nulasta(Amgen)和刚批准的PEG化IFNb(BiogenIdec),利用末端氨基与Lys氨基解离常数的细微差异,在N末端定点修饰,添加了一个20kDa的直链PEG;Bayer公司的PEG化重组人凝血八因子,通过蛋白质工程引入半胱氨酸,利用巯基进行定点修饰;诺和诺德公司(NovoNordisk)则着重发展糖基化PEG修饰技术,即利用酶促反应,将PEG分子偶联到蛋白分子糖末端的唾液酸上(重组7,8,9因子);而Ambrx公司的ReCODE技术,则是通过非天然氨基酸引入特异性的活性基团进行修饰,目前定点修饰的GH在Ⅱ期临床。除此之外,利用酶催化也可将PEG添加到特定序列和氨基酸残基上。PEG修饰蛋白药物,和抗体交联药物类似,由于需要在蛋白质上进一步修饰,对于质量研究、工艺控制、产品质控都有很高的挑战。对于相对分子质量相对小的细胞因子、生长激素等蛋白来说,PEG化带来的位阻效应阻碍与相应受体的结合而导致表观活性降低。修饰后药物由于体内半衰期延长,生物学活性往往更高。这种PK/PD的不一致性,需要在开发这一类药物时引起足够的重视。2聚丙胺pas-解决方案最近几年出现了模拟PEG修饰的替代技术,是在蛋白药物上链接一个无空间结构的亲水长肽链从而使药物的半衰期大大延长。例如美国Amunix公司的XTEN技术。该技术的主要优势是:(1)可以通过基因工程的方法将该PEG多肽类似物与蛋白药物融合表达,无需任何化学修饰及修饰后的纯化步骤。可在大肠杆菌中可溶性表达,产量和收率较高,生产成本比PEG修饰蛋白大大降低。(2)与PEG修饰蛋白相比,避免了化学修饰本身固有的一些缺陷,如工艺较难控制、质量表征困难等问题,产品均一性好。(3)该修饰产品在体内可正常代谢降解,不会在体内大量蓄积。但无空间结构的亲水肽链不能降低蛋白的免疫原性。运用该技术,Amunix公司已联合开发了几个长效产品:如用于Ⅱ型糖尿病治疗的Exenatide-XTEN(VRS-859)已进入Ⅰ期临床、用于生长激素缺陷治疗的hGH-XTEN(VRS-317)已进入Ⅱ期临床,也在和Biogen公司合作开发长效凝血八因子。另外,ArneSkerra团队开发的PAS化技术,通过设计一具有稳定随机构象,200到600个氨基酸大小的蛋白质,可以基因融合至蛋白药物的N或C端延长半衰期。目前项目处于临床前开发阶段。3时间和体外活性许多血浆蛋白具有丰富的N糖和O糖翻译后修饰,研究已表明N-糖蛋白通过末端富含唾液酸的糖基化增加水化半径和蛋白质的负电荷,从而降低降低肾小球过滤并减少受体介导的内吞作用,显著增加蛋白半衰期,同时由于唾液酸亲水性好,糖基化蛋白的溶解性和稳定性也较高。此外,糖基化蛋白也可以通过糖基末端的甘露糖、乙酰氨基葡萄糖或海藻糖,经由凝集素样受体介导避免蛋白的降解。因此可以通过添加糖基化修饰位点,利用重组蛋白的翻译后修饰提高半衰期。例如:已上市的高度糖基化EPO———Aranesp,通过额外添加了两个N糖修饰位点,半衰期延长了3倍。长效IFNa衍生物,含有5个N糖位点,虽然体外活性有所降低,然而由于半衰期显著提高(25倍),体内活性得以提高。已上市的长效卵泡刺激素(Elonva)通过C端添加hCGb亚基的一段富含O糖修饰的羧基末端肽(CTP)序列,半衰期提高了1倍,给药频率在一定程度上得到了降低。与添加糖基化修饰位点,利用重组蛋白的翻译后修饰增加糖基化相对应的,是通过化学修饰的方法添加糖链延长半衰期。例如:羟乙基淀粉(HES),从糯玉米中分离出的支链淀粉,是被批准的修饰剂,具有良好的安全性,且由于结构与糖苷类似,不存在免疫原性问题。可以通过化学反应调整HES的大小及结构,从而调整偶联药物的半衰期。HES化技术由Fresenius公司开发,例如:将EPO蛋白化学偶联60KDa的HES。近年来,聚唾液酸(PSA)修饰技术也得到一定的发展,PSA发现于细胞膜表面,是一种生物相容性和可生物降解的天然高分子。具有代表性的是Lipoxen公司的PolyXen技术,有多个经聚唾液酸化修饰的蛋白药物处于临床及临床前研发阶段,例如:长效EPO(ErepoXen),胰岛素(SuliX-en)。壳聚糖,从葡萄糖单体衍生出来的一天热多糖,由于结构复杂,经化学修饰后的产物不均一,应用相对较少。在引入糖基化位点时需要确认糖基化修饰完全,避免高Mannose和一些有潜在免疫原性的糖结构。和PEG修饰类似,糖基化也可能导致PK/PD不一致。由于糖基化是关键质量属性,多糖基化蛋白药物的工艺控制有很大挑战性。4蛋白质饮料的相对分子质量在血浆蛋白中,IgG、白蛋白和转铁蛋白的半衰期要长于其他蛋白。这3种蛋白相对分子质量大于肾脏过滤阈值,能够在内吞后再循环,在人体内半衰期可达2~3周。蛋白质、多肽和这些蛋白融合后,往往可以显著增加半衰期。4.1降低血液中溶酶体的降解在自然环境下,免疫球蛋白IgG1,IgG2,IgG4亚型虽然也会受到由抗原-受体介导的细胞内吞及降解的影响,但由FcRn介导的再循环机制起主导作用使其半衰期较长,约3~4周。免疫球蛋白与FcRn的作用位点为Fc区域,在酸性环境下,IgG与细胞膜上的FcRn相结合,避免了溶酶体的降解。在中性环境下,重新被释放到血液中。越来越多的Fc融合蛋白药物应用到临床治疗中,除了可以提高半衰期以外,还可以利用Fc形成二聚体,提高药效。由于结构限制,Fc一般融合在靶标蛋白的C端并形成二聚体,这种融合方式往往导致生物学活性显著降低。对于某些蛋白,单价融合或其他融合方式可能更有利。此外,目前Fc主要采用IgG1亚型的,可能会有由于ADCC和CDC活性带来的不必要的副作用。这些在设计融合分子的时候都要仔细评估。国外有多个Fc融合蛋白上市或处在后期临床研究阶段。其中Entenercept(TNFR2-Fc),Aflibercept(VEGFR2-Fc)和Abetacept(CTAL4-Fc)等已成为重磅药物。国内除了TNFR-Fc(益赛普)和VEG-FR-Fc(康巴昔普)上市之外,也有一些处在临床或临床申报阶段,如GCSF-Fc和重组人促卵泡激素(FSH)Fc融合蛋白注射液。4.2glp-1和fc的融合人体中白蛋白主要在肝脏中合成,经由内皮细胞进入到血管内部,在正常人体中的浓度约34~54g·L-1。它是人体许多分泌物的组成部分,例如:乳汁、汗液、眼泪等,在人体中半衰期19d,最终在皮肤或肌肉中被降解。其较长半衰期和Fc类似,也是通过依赖于pH的FcRn介导的,与FcRn的作用位点和Fc的不重叠。蛋白药物通过化学修饰或基因融合的方式与白蛋白结合。例如:ConjuChemLLC公司的PC-DACTM技术,在给药前多肽药物与HSA相结合,使GLP-1的半衰期延长了6000倍以上。Balugrastim,G-CSF与HSA基因C端融合,目前已完成临床Ⅲ期试验,半衰期提高了7倍以上,且意外的是通过与白蛋白融合G-CSF聚体减少。GSK的GLP-1-HSA的融合蛋白已获批上市,给药瓶率降低到每周1次。CSL的rFVIIa-FP和rIX-FP与HSA基因N端融合,Merrimack在研的双特异性抗体片段,依次与HSA基因N和C端融合,目前均在临床试验阶段。4.3不同动物模型对hsa-药物融合物pk结果的影响与Fc和HSA融合相比较,Tf融合应用相对少。Tf与其受体在内吞体中,pH降低时和受体解离而避免进入溶酶体降解。糖基化和非糖基化的Tf人体半衰期大约为14和10d。与Tf融合可以显著增加蛋白和多肽的半衰期。由于Tf作为转运分子的特性,通过特定的改造,有可能使得融合蛋白穿透血脑屏障。不同种属的FcRn具有一定的同源性,但是对于IgG和白蛋白的结合差异有显著差异。因此要审慎解释不同动物模型获得PK结果及其外延到人体使用的情况时。另外,研究表明,抗体或Fc融合蛋白和FcRn的亲和力,与其体内半衰期具有相关性。例如:Xencor和Medimmune等公司通过蛋白质工程技术,构建Fc突变体,提高与FcRn的亲和力,在动物实验中发现半衰期显著提高,但是还缺乏人体试验数据的验证。根据HSA与FcRn的作用机制,近年来人们尝试运用基因工程的方法,获得与FcRn不同亲和力的HSA变体,从而调控药物-HSA融合物的半衰期,满足不同药物的临床需求。在采用动物模型进行HSA-药物融合物PK评估时,需要考虑不同动物种属之间的差异。因为鼠源白蛋白与人FcRn(hFcRn)、鼠FcRn(mFcRn)的亲和力依次为HSA的5,10倍以上,不同种属间差异较大。在采用不同动物模型外推HSA-药物融合物PK情况时,需要充分理解内源白蛋白,内源FcRn和HSA-药物融合物(与同一受体的不同亲和力,不同的血液浓度)的复合作用。5输注前氨基酸类似物由于Fc和白蛋白相对分子质量大,而且只能在蛋白的C端或N端融合,融合往往导致活性降低和其他特性改变。蛋白药物通过化学修饰或基因融合的方式与白蛋白或Fc的较小相对分子质量的结合模块相连,在进入人体后,可以通过与白蛋白和IgG结合而改变组织分布和降低肾脏过滤。各种不同的模块分子包括:天然的白蛋白结合分子,多肽、抗体片段及其他具有白蛋白结合活性的替代物。例如诺和诺德公司的德谷胰岛素,是将胰岛素B30位苏氨酸去除后,通过谷氨酸连接子,在B29位赖氨酸残基上结合一个十六碳脂肪酸,注射后德谷胰岛素分子以可溶性的多聚六聚体结构在皮下贮存,缓慢释放入血液,单体进入血液后通过脂肪酸链与血清白蛋白结合,既可以防止肾小球滤过,又可以通过受体介导的再循环机制降低清除速度,从而使其血液半衰期超过25h。年销售额已超过20亿美金的利拉鲁肽,是用脂肪酸修饰的GLP-1类似物,也是此种长效修饰的成功典范。Affibody公司的AlbumodTM技术,通过基因融合链球菌蛋白G的白蛋白结合区域(ABD),而与血液中的白蛋白特异性结合延长半衰期。目前有多个药物处于临床前研究阶段。Ablynx利用白蛋白结合的单结构域抗体和其他单结构域治疗抗体融合将单结构域抗体的半衰期从几分钟延长到2~3d。因为亲和标签一般较小,在融合或化学偶联后,往往很大程度上能够保留蛋白质药物的活性和功能。6提高和保证药物的稳定性蛋白质的理化性质由一级结构决定,通过蛋白质工程技术改变蛋白的一级结构,也可改变部分蛋白的溶解和体内释放特性。目前糖尿病治疗药物中销售额最高的甘精胰岛素就是通过通过改变蛋白序列获得长效作用的典范。甘精胰岛素是通过将胰岛素A链羧基端的天门冬氨酸用甘氨酸替换,在B链羧基端连接两个精氨酸而获得。这种改变使其等电点从5.4提高到6.7,降低了生理条件下的溶解性,皮下注射后立即聚合,形成甘精胰岛素沉淀物,延迟吸收,从而使体内作用时间延长至24h。IL2几个疏水氨基酸的改变是其成药性的关键。很多细胞因子是通过受体介导的内吞作用被清除的,可以根据结构改变与受体的结合特性,使之在内吞体内与受体解离而再循环。对于某些蛋白来说,降低与LRP家族清除受体的结合也可以增加体内稳定性。在很多情况下,蛋白质药物本身的不稳定性,以凝血八因子为例,由于蛋白本身非常不稳定,PEG修饰和Fc融合都只能带来非常有限的改善(<50%)。而针对其他凝血因子的深入研究发现,FIX和FX的体内半衰期与酶原中的激活肽(activationpeptide,AP)相关,替换AP就能显著影响体内稳定性。通过改造FIX引入FVIIa的特异活性,也可以获得长效的活性蛋白。由于免疫原性造成半衰期缩短的情况下,非定点PEG化并不能完全解决问题。这种情况下,可以考虑在免疫原性强的热点引入PEG或糖基化位点来降低免疫原性,甚至可以考虑酶活性