动物细胞培养ppt

动物细胞培养学习（一）前言

1885年Roux最早尝试使组织离体培养，材料是鸡胚神经板，采用生理盐水为培养液，并首次采用组织培养这个术语。1907年Harrison和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞的培养。组织培养中热门的研究领域

1)细胞内部的活动，如DNA的复制和转录、蛋白质合成、能量代谢；2)细胞内部的流动，如RNA从细胞核向细胞质方向运转，激素受体复合物的易位等；3)生态学，如营养、感染、病毒或化学诱变、药物作用；4)细胞与细胞之间的相互作用，如胚胎诱导、细胞群体的动力学等。组织培养的分类及基本概念

分类:1.组织培养(TissueCulture)2.细胞培养(CellCulture)

3.器官培养（OrganCulture）组织培养的细胞生物学特点:1.体内外细胞的差异：当人工条件和体内实际情况不完全相同时，细胞在体外培养后，一旦失去神经体液调节和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生变化则是必然。细胞最多见的表现是：返祖（Atavism）现象，即失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、细胞趋单一化、不死性、恶性状。2.细胞增殖和分化：是细胞生命进化中所获得的基本属性，增殖使细胞数量增多；分化使机体结构和功能多样化，最后演变成完整的有机体。培养细胞的分化

细胞分化机制是极其复杂的，是在细胞与细胞、细胞与体液和细胞与细胞外基质相互作用下，众多基因参与、经过多阶段和多环节完成的动态演变过程。不适应（Deadaption）细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显。脱分化（Dedifferentiation）

由于基因变异而使细胞失去分化能力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基酸转移酶的特性后，储存肝糖元的能力培养细胞的分化

不适应和脱分化两个概念不同：不适应是因为生存条件改变而使分化发生抑制；从分子水平考虑，脱分化很可能是基因变异所致。培养细胞的分化

培养细胞的形态

1.贴附型：1）成纤维细胞：心肌细胞，血管内皮细胞等2）上皮型细胞：消化管外皮细胞，肝脏上皮细胞等3）游走型细胞：神经胶质细胞4）多形型细胞：神经组织细胞2.悬浮型：如癌细胞培养细胞的生长和增殖

1.原代培养（PrimaryCulture）阶段：或称初代培养。从体内取出组织接种培养到第一次传代，随不同的组织时间长短不一，一般为1~4w2.传代培养（Subculture）阶段：或称继代培养。也就是细胞系（Cellline）阶段，细胞增殖旺盛，一般细胞可传代10-50代）。3.衰退阶段：自发性转化（SpontaneousTransformation）：其标志是获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）:细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系(Infinitecellline)或连续细胞系(Continuouscellline)。

培养细胞的生长和增殖

培养细胞的传代培养

当细胞生长达到一定密度后，需要做传代处理，传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖速度有关。细胞传代的三个阶段

1）潜伏期（Latentphase）：细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。二倍体细胞该期时间长（24~96h）；连续细胞系时间短（10~30min）。

2)指数生长期（Logarthmicgrowthphase）：细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数（Mitoticindex，MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数介于0.1~0.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。3)停滞期（Stagnatephase）：即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，PH下降细胞停止增殖，进入停滞期。在此时应及时进行换液传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再传1-2代后，细胞才能恢复。细胞培养的基本条件

1)仪器和设备:常规的细胞培养设备：如CO2孵箱；培养器材：如培养瓶，纯水设备，干燥消毒除菌设备，清洗设备等。2)培养液:目前常用的基础培养液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F12等，可根据培养需求合理选择。细胞培养的基本条件

3)血清：一般常用为小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它动物血清。4)平衡盐溶液:常用的有PBS，Hank’s等。5)抗生素:常用为青霉素（每毫升培养液50~100单位）和链霉素（每毫升培养液50~100微克）。6)其它添加成分：缓冲系统，常用为HEPES（N’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonicacid），缓冲效能(pKa)在20℃时为7.55，37℃为7.31；HEPES不是起维持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH变化的，所以调整pH常常用NaHCO3溶液。有机补充物，如丙酮酸钠，谷胺酰氨等。促细胞分裂因子，如生长因子类的FGF(成纤维细胞生长因子)，EGF(表皮生长因子)。贴壁和铺展因子，如胶原蛋白，纤粘蛋白等。可根据培养细胞的特殊要求进行添加。细胞培养的基本条件培养液的物理性质

pH值：大多数细胞在pH7.4时生长最好，一般不低于6.8，不高于7.6。酚红是常用的指示剂，用来检测PH的变化：红色--pH7.4，橙色--pH7.0，黄色--pH6.5，蓝红色--pH7.6，紫色--pH7.8。温度：温度除直接影响细胞生长外，还与培养液的pH值有关，温度低时CO2溶解性增加，从而影响pH。渗透压：培养液渗透压一般介于260~320mosm/kg之间。人类血浆渗透压290mosm/kg，小鼠类为310mosm/kg。粘度：由于血清的存在，直接影响培养液粘度。表面张力：培养液的表面张力有利于培养物粘着于底物上面。培养液的物理性质

细胞培养的基本方法

1.组织、细胞的解离方法1.1解离组织：在无菌情况下采取动物的组织或器官，放在含有抗生素的平衡盐溶液(BSS)中，然后尽快在超净台或无菌室内进行解离处理。解离时应注意:1)尽可能将脂肪和坏死组织去除干净；2)剪碎组织时，避免损伤组织块；3)解离组织用的各种酶系，需要先进行低速离心。解离细胞常用酶和鳌合剂进行解离：当实验室需要制备具有均匀细胞层的培养物；从单个细胞出发获得细胞群体；从一定量的组织中获得最多的细胞量时。解离细胞的方法1）胰蛋白酶解离细胞法2）胶原酶解离细胞法3）机械解离细胞法4）螯合剂解离细胞法原代细胞培养

1）外植块培养：外植块在一定限度内可保持其原有组织结构，有利于其适应体外培养环境。短期培养的外植块成为细胞培养的材料来源之一。2）单层细胞培养：每隔1~3d换液一次，细胞长成单层后传代培养。3）悬浮细胞培养：使细胞成悬浮状态在培养液中连续生长。由于细胞本身是不粘附的，如小鼠白血病细胞和腹水肿瘤细胞；通过机械搅动使细胞保持悬浮状态；通过选择培养得到能悬浮生长的细胞进行悬浮培养。原代细胞培养

培养细胞的污染问题及检测

细胞培养的污染问题十分重要，一旦发生污染，将导致前功尽弃。所以细胞培养一定要建立无菌观念。遇到培养污染要分析原因，及时处理。细胞污染的种类和判定

1)培养液的酸碱度发生异常的改变。2)培养液出现混浊。3)光镜观察到菌丝和颗粒。4)细胞出现死亡或增殖缓慢等。污染物的检测

1.细菌和真菌污染的检测：1）涂片染色镜检；2）接种培养：Trypticase大豆肉汤、BHI、Thioglycocollate肉汤和血琼脂板适于广泛的细菌检测；Sabouraud肉汤、YM肉汤和营养