弯孢属斑点组中相似种和难分类地位的rapd分析

弯孢属斑点组中相似种和难分类地位的rapd分析

curvneris是玉米、水稻、牧场、草坪和其他植物的重要致病性物质。现在，一些类似种子主要取决于生殖器形态和大小。在研究中，发现了线唑菌组（macia盾）中几种菌株的分生殖器形状和大小差异很大。有些难溶性，有些问题的特点是错误的，部分菌株很难产生。很难根据形态特征正确识别。radt技术简单、快速、灵活化慢，因此很难正确识别。在这项研究中，我们试图使用dns指数来验证具有使用价值的分类模式，并探索这些类型种子的分类和鉴定。从遗传本质上揭示遗传特征的差异，并通过生物学和形态特征的结合来解决难以分类的问题。1材料和方法1.1试验中的蘑菇本试验选用23株弯孢属菌株进行种间及种内RAPD分析(表1).1.2病原菌培养和活性包装供试菌株从试管斜面上移至PDA平板培养基上培养3d,用内径5mm的打孔器于菌落边缘打取菌圆片,移植到100mLPD培养液中,25℃条件下摇床振荡培养2d,4层纱布过滤菌丝体,用无菌水冲洗,再用灭菌的吸水纸吸去水分,-20℃保存备用.1.3菌体dna的提取纯化对所有的菌株利用液体培养后收集菌体,再采用CTAB(CetyltriethylammoniumBromide)法进行菌体DNA的提取和纯化.1.4热价2,2min用供试23个菌株的混合模板对100个随机引物S1～S40,S140～S200进行筛选,从中筛选出适合试验分析的随机引物.扩增程序为:94℃,3min;94℃,50s;36℃,50s;72℃,2min;35个循环后72℃延伸7min.采用25μL扩增体系,在0.5mLEppendorf管中依次加入以下成分:无菌超纯水17.84μL,含Mg2+的10×Buffer2.5μL,各含2.5mmol·L-1的dNTP0.5μL,2.5mmol·L-1的MgCl21.8μL,5U·μL-1的Taq酶0.36μL,5pmol·μL的引物1.0μL,模板DNA1.0μL.扩增产物在1%的加溴化乙锭的琼脂糖凝胶上,用TBE电泳缓冲液,上样8μL,4V·cm-1电泳3h,254nm紫外光下检测,照相.1.5rad扩展用筛选出的引物对23个菌株进行RAPD扩增,检测方法同1.4.重复2次.1.6rapd反应总带数的确定每个样品的扩增带存在时赋值为“1”,不存在时赋值为“0”,按公式D=1-2Nxy/(Nx+Ny)计算样品间的距离系数D.式中:Nxy代表两样品经RAPD扩增反应分子量相同的总带数;Nx表示x样品扩增反应的总带数;Ny表示y样品扩增反应的总带数.采用非加权对数算术平均法(UPGMA),利用STATISTIC软件自动生成距离距阵和UPGMA聚类图.2结果与分析2.1引用试剂筛选的结果用23个菌株的混合模板从100个随机引物中筛选出15个能够扩增出较多DNA片段,谱带清晰,带型稳定,具有多态性的随机引物.2.2树状聚类分析利用15个引物对23个供试菌株扩增后,都得到了稳定的RAPD谱带.供试的15个引物扩增出的多态性RAPD标记列于表2.从表2可以看出,扩增出的232条带100%都具有多态性.即对于23个菌株,15种引物扩增的232条带没有一条是共同的.从图1和图2可以看出每个种的种内菌株间带形相似,种间带形差异较大,每个种都有各自独特的扩增带形.将15个引物扩增的232条谱带进行记录,有带的记为“1”,无带的记为“0”.采用不加权对数平均法(Unweightedpair-groupaverage)进行聚类分析,算出其23个菌株的欧氏距离.再由距离矩阵产生树状图(图3).从图3可以看出,在以连锁距离为8.2时,可以将大多数以形态特征鉴定的种明显区分开,23个菌株明显分成9个组:1组(CU733,CU644),2组(CU139),3组(CU865),4组(CU860),5组(CU836),6组(CU767),7组(CU705,CU800,CU708,CU782,CU773,CU809,CU847,CU532),8组(CU845,CU815,CU541,CU474,CU830,CU009,CU791),9组(CU612).1组至5组分别代表了5个从形态上鉴定的独立的种,即新月弯孢(C.lunata),仙茅弯孢(C.curculiginis),具瘤弯孢(C.tuberculata),水稻弯孢(C.oryzae),短孢弯孢(C.brachyspora),从树状聚类图上可以明确区分.6组包含一个菌株,从形态上鉴定为间型弯孢(Curvulariaintermedia),但是在树状聚类图上与其它间型弯孢相距较远,在较大的连锁距离上与短孢弯孢聚在一起.7组包含从形态上鉴定为间型弯孢的8个菌株,在形态大小上存在较大差异,在树状聚类图上也明显反应出种内的遗传分化.8组包含从形态上鉴定为画眉草弯孢(Curvulariaeragrostidis)的7个菌株.9组包含一个形态上部分分生孢子象画眉草弯孢,部分分生孢子又象短孢弯孢的疑难种的1个菌株.3rapd分析1)本研究对弯孢属斑点组仙茅弯孢(C.curculiginis),具瘤弯孢(C.tuberculata),水稻弯孢(C.oryzae),短孢弯孢(C.brachyspora),间型弯孢(C.intermedia),画眉草弯孢(C.eragrostidis),酢浆草弯孢(C.oxalis),一个疑难种(C.sp.)和模式种新月弯孢(C.lunata)的23个菌株进行了RAPD分析.6个斑点组弯孢和模式种新月弯孢彼此间从树状聚类图上可以明确区分,与形态上的鉴定结果一致.2)从前人的描述看,间型弯孢与短孢弯孢形态上相似,主要区别为短孢弯孢的分生孢子较小,中隔膜增厚色深.本研究发现,间型弯孢大多数分离物的分生孢子有中隔膜加厚、色变深的趋势,因此中隔膜增厚不应成为区别这2个种的主要特征,在树状聚类图上这两个种关系较近.间型弯孢的不同分离物遗传距离较大,分离自亚麻上的CU767菌株与其它间型弯孢相距较远,独立成为1组,在较大的连锁距离上与短孢弯孢聚在一起,其分类地位有待于进一步确定.3)分离自石竹上的疑难种CU612菌株,形态上部分分生孢子象画眉草弯孢,部分分生孢子又象短孢弯孢,其连锁距离