电针足三里三阴交穴改善脾虚证大鼠能量代谢作用机制的研究

电针足三里三阴交穴改善脾虚证大鼠能量代谢作用机制的研究

实验中选择了美国军官的干净雄性大鼠。它的雄性为180.200g，三个月内有48例。由陆军军事学院实验动物中心（军队）提供。随机数字表分为4组，每组12只。造模方法采用饮食不节和过度劳倦塑造脾虚模型:第1~7天自由饮食饮水,每日观察并记录大鼠食量水量。第7天称重。第8~32天单日喂食甘蓝15~20g/只,自由饮水;游泳至耐力极限(指大鼠游泳至口鼻部首次浸入水中),每只双日喂饲猪油脂1.5mL/100g。第32天按下列标准评估:(1)体重的减轻,消瘦;(2)肛温无明显变化或降低;(3)粪便时软、时溏(拉尾排便次数的增多,便形溏稀,肛周污秽);(4)食量的减少;(5)游泳耐力的下降;(6)倦怠,懒动,蜷缩聚堆,眯眼,弓背。评估大白鼠脾气虚证的主要依据有4个方面的文献标准:(1)大白鼠的生物学特征;(2)卫生部药政司《关于中药治疗脾虚证的临床研究指导原则》中的诊断标准;(3)在全国具有一定影响力的专著:《实用中医基础学》(李德新,1985),《21世纪课程教材-中医基础理论》(李德新,2001),《实用中医证候动物模型学》(陈小野,1993);(4)1986年全国中西医结合老年病防治学术会议确定的“中医虚证辨证参考标准”。造模成功后空白对照组继续给予自由饮食饮水;模型对照组继续施加造模因素,其余各组停止施加造模因素;针刺治疗组和中药治疗组进行以下干预。针刺治疗组:捆绑束缚后针刺治疗组电针“足三里”穴、“三阴交”穴各20min,每天同一时间,连续15d。模型对照组及空白对照组捆绑束缚20min不针刺。电针参数:疏密波,频率2Hz,强度2V。足三里取穴:大鼠膝关节后外侧,腓骨小头下约5mm(参照林文注《实验针灸学》,上海科学技术出版社,1994)。“三阴交”取穴:大鼠内踝尖直上约5mm,胫骨内侧缘(参照林文注《实验针灸学》,上海科学技术出版社,1994)。取穴方法选用皮肤电阻测定法。中药治疗组:将配制好的中药四君子汤:人参10g、白术9g、茯苓9g、炙甘草6g(购于辽宁中医药大学中药局)正常煎煮2次,煎剂放入70℃恒温水浴锅蒸发浓缩,药液浓缩成每毫升相当于1g生药浓度。依据等效剂量直接计算法,将成人临床用量,换算大鼠用量。相当于每日1.2mL/100g。每日按照上述剂量对中药治疗组大鼠进行灌胃,每日1次。模型对照组采用生理盐水每日1.2mL/100g,胃饲。实验第47天对4组大鼠进行体重、肛温、游泳耐力、食量、水量的测定。然后采用腹主动脉取血法进行标本制备。用10%水合氯醛按0.3mL/100g腹腔内注射麻醉大鼠。大鼠麻醉后,仰卧固定于大鼠手术台上。常规消毒后用手术剪沿腹正中线剪开腹腔。充分暴露腹主动脉。术者右手持注射器,针尖方向朝上,入针角度约25°~30°,朝向心端方向刺入,与血管保持平行,深度约5mm左右。取血2mL(摘去注射器针头),沿试管壁缓慢注入事先加好抑肽酶40μL,EDTA-Na230μL的试管中,轻轻振荡混匀,然后快速4℃离心(3500r/min)10min,取上清,于-20℃低温冰箱保存待测。大鼠内皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)含量检测方法按试剂盒说明书进行操作。以上所有数据用x—±s表示。实验结果采用SPSS软件17.0版本进行处理。两组间均数比较采用t检验;多组间均数比较采用单因素方差分析;组间均数两两比较采用ANOVA中的LSD多重比较方法。2.1一般资料检测,云病情报应与中药治疗大鼠体重、饮水量、第三人体重增的比较见表1实验第47天,测定各组大鼠体重、肛温、游泳耐力、食量、饮水量,并观察其它状态。具体方法如前所述。见表1~2。由表1、2可以看出,治疗后,模型对照组、中药治疗组和针刺治疗组的体重、游泳耐力仍低于正常组(P<0.01),但针刺组和中药治疗组的体重、游泳耐力,已明显增加,与模型组相比有统计学意义(P<0.05)。饮食量及进水量与模型组相比均有显著差异,肛温变化不明显。结果提示:本次实验中,体重、游泳耐力的变化有统计学意义。脾气虚证造模方法使其相应模型对照组大鼠体重出现相应减轻。四君子汤治疗后能使其相应大鼠体重增加;针刺对于模型大鼠体重的增加作用与中药治疗组相同,可以接近正常水平。而食量和饮水量的变化由于计算的是平均值,并没有做统计学处理,但是从表中可以看出中药治疗组和针刺治疗组与模型对照组有一定差异。实验过程中,模型对照组大白鼠形体消瘦、弓背、眯眼、倦怠、懒动、蜷缩,排便增多,粪便时干时软,肛周污秽。空白对照组大鼠体重适中,活动自如,反应灵敏,皮毛光泽,大便未见异常。中药治疗组、针刺治疗组大鼠状态与空白对照组治疗后均有所好转。针灸治疗组、中药治疗组大白鼠体征及其它状态等与模型对照组相比,均有一定程度的改善。虽然有些指标并未恢复到正常值水平,但是可以确定的是针灸和中药具有非常显著的治疗效果,且效果相同。2.2针刺治疗组和空白对照组输注后cci比较见表3。上述数据显示:模型对照组与空白对照组相比,血清中ET-1含量显著升高(P<0.01),针刺治疗组血清中ET-1含量明显低于模型对照组(P<0.01),但从图1看出,针刺治疗组仍高于空白对照组(P<0.05),而针刺治疗组与中药治疗组相比,无显著差异(P>0.05)。见表4,图2。上述数据显示:模型对照组与空白对照组相比,血清NO显著降低(P<0.01),针刺治疗组血清NO明显高于模型对照组(P<0.01),而针刺治疗组与中药治疗组相比无显著差异(P>0.05)。3中药结合模型脾气虚证一直是近年研究的热点,现代医家通过大量的临床观察和动物实验研究发现,中医学的脾虚证涵盖了现代医学中消化系统、内分泌系统、免疫系统等多系统的疾病。朱兆洪等以大黄灌胃造成小鼠脾虚模型,同时针刺“足三里”穴来观察对一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性的影响。结果表明,针刺“足三里”能够降低脾虚动物脑组织中NO含量及NOS的活性,提高红细胞SOD活性和肾组织中总抗氧化能力(T-AO),减少心肌组织丙二醛(MDA)的生成。并认为针刺“足三里”能够改善脾虚动物机体内自由基代谢。吴兆利等采用中医脾虚动物模型和西医哮喘动物模型的复合造模方法,建立大鼠脾虚哮喘病证结合模型,采取针刺“足三里”的方法进行治疗。通过采用双抗体夹心酶联免疫法(EL1SA)检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中TGF-p、GM-CSF的浓度。结论显示脾虚加重气道炎症反应是通过影响炎症细胞凋亡调控因子的浓度来实现的。针刺“足三里”具有促进模型大鼠BALF中低水平TGF-p浓度的增高、抑制GM-CSF浓度增高的作用。本实验通过饮食不节和过度劳倦塑造脾虚模型,双日胃饲猪油脂属肥甘厚味,单日限量喂食甘蓝并游泳至体力极限,饮食劳倦则伤脾,导致动物脾气虚弱而致脾失健运,运化不足,水谷精微不能运化而变为脂浊,至全身聚而生痰,而致血流缓慢血液黏度大,极易导致临床上常见的高血压、高血脂及动脉粥样硬化等疾病。这也为日后做深层次的研究做铺垫。血管平滑肌细胞的生物学变化可引起血管壁的增厚、管腔狭窄、血管顺应性的降低以及血管重构,在高血压、动脉粥样硬化、高血脂等血管平滑肌增殖性疾病的发生与发展有中其重要作用。血管平滑肌细胞对不同血管活性物质刺激可以呈现不同的敏感性。本实验中,脾气虚大鼠模型血清中ET的含量较对照组显著增高,而NO含量降低,二者之间的平衡被打破,势必会引起血管平滑肌的异常收缩或其他的病理改变,而中药治疗组和针刺治疗组能够降低大鼠血清中ET的含量,提高NO的含量,同时降低血管平滑肌的张力、降低外周阻力而达到抑制血管重塑进程的目的,并以此改善脾气虚证大白鼠的症状