莪术对pxr介导cyp3a4转录调节作用的研究

莪术对pxr介导cyp3a4转录调节作用的研究

cyp3a是肝脏中的主要药物代谢酶，约60%的药物通过cyp3a代谢。然而，在最近的研究中，发现cyp3a4基因转移是由孕烷x受体（pxr）引起的。最近研究表明:很多中草药都对CYP3A酶有调控作用。莪术作为一味传统中药,具有抗肿瘤、抗病原体、增强免疫、抗炎、抗早孕、降酶等多种药理作用。因联合用药日益普遍,使药物间的相互作用倍受重视。药物对CYP活性的影响是药物间相互作用的重要机制之一。本实验研究莪术对主要的药物代谢相关的CYP3A同工酶的影响并探讨其诱导机制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1药品检验所和产品规格莪术购自福州回春大药房,经福建中医学院生药室鉴定;莪术油、莪术醇(Crucumol)、桉油精(Cincole)和异龙脑(Isoborneol)均购自中国药品生物制品检定所,产品批号分别为:111544、100185、110788、111512;利福平(rifampicin,RIF)购自Sigma公司,产品批号为:103k0670;莪术醇、桉油精、异龙脑、青蒿素(Artemisinin)、紫杉醇(Paclitaxel)和利福平的分子结构式见Fig1。1.1.2细胞材种:hepg2细胞株♂大鼠,普通级,体重180～230g,由福建医科大学实验动物中心提供;人肝癌HepG2细胞株购自第四军医大学;质粒pGL3-3A4-Luc、pCI-hPXR、pSV-β-Gal均由美国TexasA&MUniversity的田亚楠教授惠赠。1.1.3质粒、酶、培养基DMEM购自Hyclone公司,批号:Cat*No.SH30021.01;小牛血清购自HyclonePierce公司,产品批号:ATC:9934;质粒抽提试剂盒购自QIAGEN生物有限公司;LipofectaminTM2000脂质体购自Invitrogen生物制品有限公司;荧光素酶购自Promega公司;地塞米松磷酸钠注射液购自福州海王福药有限公司,产品批号060902;TRIzolReagent、RT-PCR试剂盒购自Invitrogen公司;红霉素购自Sigma公司。1.2外部实验方法1.2.1dmem溶液中药莪术提取物的制备采用水加醇联合萃取方法。中药标准品的处理方法:用1mlDMSO浸泡40mg标准品,配制成4×104mg·L-1的母液,用DMEM稀释成浓度分别为0.5、1.0、5.0、25和50mg·L-1的储备液,漩涡振荡约5min后于4℃冰箱中避光保存过夜。使用前漩涡振荡约1min,3000r·min-1离心约1min,取上清液进行以下实验。1.2.2细胞转导dmem用脂质体瞬时转染法将纯化后的pGL3-3A4-Luc、pCI-hPXR和pSV-β-Gal3种质粒按照质量比1∶1∶3的比例,同时转染HepG2细胞。每孔转染质粒总量为0.9μg,用无血清的DMEM50μl分别稀释质粒0.9μg和脂质体1.8μg,将两者混合后,于37℃放置15min使其形成LipofectaminTM2000复合物,使其与原有培养液混匀。将培养板置于37℃、5%CO2条件下培养6h,加入含有不同浓度药物的DMEM培养液,同样条件下继续分别培养24、36、48h。然后,吸出待测细胞的培养液,加入细胞裂解液RLB150μl,室温放置20min。将细胞轻轻刮下,转移至离心管(冰浴)中,漩涡振荡15s,然后于12000×g离心2min(4℃)。取上清液20μl,加入100μl荧光素酶,于酶标仪上测定荧光素酶活性值,结果用OD值表示。1.3内部实验方法1.3.1各组大鼠血清中5.0.0.0.0.0.0.0.5.4地塞米松阳性对照30只大鼠随机分为空白组、4.0×103mg·kg-1莪术组、2.0×103mg·kg-1莪术组、1.0×103mg·kg-1莪术组、80mg·kg-1地塞米松(阳性对照)组,其中每组6只。空白组给生理盐水,各药物组按上述剂量,连续灌胃给药,6d后处死动物,取其肝组织。1.3.2肝cyp450总含量测定采用钙沉淀法制备肝微粒体,微粒体蛋白浓度采用Lowry法测定。采用CO还原差示光谱法测定肝CYP450总含量;采用分光光度法测定红霉素N-脱甲基酶(erythromycinN-demethylase,ERD)活性。1.3.3目的基因片段的pcr扩增按TRIzolRNA提取试剂盒说明书提取肝组织RNA。按照RT-PCR试剂盒说明书进行逆转录操作。以上述逆转录产物为模板,进行PCR扩增目的基因片段。PCR反应条件为:94℃预变性4min,进行PCR扩增(94℃45s、56℃1min、72℃1min),经26个循环后,在72℃延伸7min。取10μl反应液在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,检测时以看家基因(CYC)的RT-PCR产物为内参,计算CYP3A1、CYP3A2与CYC基因扩增条带表达量像素灰度的比值作为其基因mRNA表达的相对水平。引物序列见Tab1。1.4药物诱导能力对于体外实验,溶剂对照组的荧光素酶活性值作为基础表达(统计分析时以1表示),以各药物组的荧光素酶活性与其的比值来反应诱导能力。实验结果以ˉx±s表示,应用SPSS13.0统计软件进行正态分布性检验和方差齐性检验分析,并比较采用两独立样本的t检验。2结果2.1pxr和诱导cyp3a4的转录表达本实验以DMSO为阴性对照和RIF为阳性对照,通过不同浓度药物对CYP3A4转录调节作用的研究发现,药物作用于HepG2细胞24h后,浓度为50～500mg·L-1之间的莪术提取物和浓度为0.5～50mg·L-1之间的莪术醇、桉油精、异龙脑,均能激活PXR和诱导CYP3A4的转录表达。经直线回归分析,莪术提取物(回归方程:ˆY=0.0116X+1.2951‚r2=0.968‚t=4.365‚Ρ=0.022),莪术油(回归方程:ˆY=0.0582X+1.4634‚r2=0.874‚t=4.569‚Ρ=0.019),莪术醇(回归方程:ˆY=0.0766X+1.3962‚r2=0.954‚t=5.735‚Ρ=0.010),桉油精(回归方程:ˆY=0.0856X+1.3885‚r2=0.976‚t=7.140‚Ρ=0.006),异龙脑(回归方程:ˆY=0.0607X+1.4121‚r2=0.881‚t=4.355‚Ρ=0.022)的诱导能力均随药物浓度的增大而呈增强趋势(Tab2)。2.2最大诱导个数的确定选取在剂量-效应关系中诱导能力最强的500mg·L-1莪术提取物组和50mg·L-1莪术有效成分各组进行不同处理时间的研究。在12～48h内莪术提取物、莪术醇、桉油精和异龙脑均能增强PXR介导的CYP3A4的转录表达。除异龙脑在24h时达到最大诱导倍数之外,其余各组的最大诱导倍数均在48h出现。经直线回归分析,500mg·L-1莪术提取物(回归方程:ˆY=0.0448X+5.63‚r2=0.985‚t=31.852‚Ρ=0.020)‚50mg·L-1莪术油(回归方程:ˆY=0.099X+1.37‚r2=0.981‚t=3.171‚Ρ=0.087)和50mg·L-1莪术醇(回归方程:ˆY=0.0253X+4.285‚r2=0.952‚t=23.805‚Ρ=0.027)的诱导能力均随时间延长而呈增强趋势;50mg·L-1桉油精(回归方程:ˆY=0.0032X+5.525‚r2=0.974‚t=6.120‚Ρ=0.002)和50mg·L-1异龙脑(回归方程:ˆY=0.0061X+3.475‚r2=0.066‚t=4.761‚Ρ=0.132)无类似作用(Tab3)。2.3不同剂量的50酶诱导作用d后,莪术提取物对CYP450含量有上调作用,表现出对CYP450酶整体上的诱导作用。其中,4.0×103mg·kg-1和2.0×103mg·kg-1组与空白组比较差异有显著性;1.0×103mg·kg-1组与空白组比较差异无显著性(Tab4)。2.4各组大鼠血清中5.0.0.0.0.5%规模率的比较d后,各剂量的莪术提取物均能够增加CYP3A酶的活性。其中,4.0×103mg·kg-1和2.0×103mg·kg-1组与空白组比较差异具有显著性,而1.0×103mg·kg-1组与空白组比较差异无显著性(Tab5)。2.5cyp3a1mrna的表达莪术提取物对大鼠肝脏CYP3AmRNA表达的影响电泳结果见Fig2、3。不同剂量的莪术提取物均可诱导CYP3A1和CYP3A2mRNA的表达。其中,对CYP3A1mRNA的调控作用中,4.0×103mg·kg-1和2.0×103mg·kg-1组与空白组比较差异有显著性,1.0×103mg·kg-1组与空白组比较差异无显著性。对CYP3A2mRNA的调控作用中,只有4.0×103mg·kg-1组与空白组比较具有明显差异,2.0×103mg·kg-1和1.0×103mg·kg-1组均无差异(Fig4)。3不同药物作用的比较及研究对象的选择细胞色素P450酶系是药物代谢的关键酶,包括中药在内的大多数药物的代谢都与它有关,而CYP450本身又可被多种药物诱导或抑制,从而改变一些药物在体内的药效和毒性,引起药物之间的相互作用。CYP3A是肝脏中含量最丰富的CYP形式,参与许多口服药物的首关效应。在成人肝脏中CYP3A4是CYP3A亚族最主要的亚型,而在大鼠肝脏中CYP3A亚族最主要的亚型为CYP3A1和CYP3A2。癌症的临床治疗常采用联合用药的方式,就有可能发生与CYP3A表达相关的药物相互作用或药物疗效的改变。因此研究中药对机体代谢药物酶CYP3A的影响对于指导临床合理用药,避免药物相互作用有重要意义。本实验研究结果表明:中药莪术能够诱导CYP3A基因的表达及提高其酶活性,其诱导机制是通过对PXR介导的信号通路而产生对CYP3A4的强诱导作用。因此它作为潜在药物相互作用的危险因子的危险性比预想的要高得多,所以我们要特别注意莪术临床应用的安全性。莪术油是从姜科植物莪术的干燥根茎中提取的挥发油,其主要成分包括莪术醇等均为多种倍半萜类物质;桉油精和异龙脑为单萜类物质。化学结构式对比结果表明:这类物质的化学结构均不同于CYP3A4的强诱导剂RIF,而与青蒿素、紫杉醇等的结构类似,都是以异戊二烯为单位的聚合体,同属萜类物质(Fig1)。而目前关于青蒿素和紫杉醇对PXR介导的转录表达研究已经证实。因此我们推测:莪术油、莪术醇、桉油精、异龙脑对PXR介导的CYP3A4的诱导作用可能与这类物质的共同结构——异戊二烯结构密切相关。但这类物质(含异戊二烯结构)有可能直接作为PXR的配体起作用还是通过其他的途径来间接激活PXR受体,目前我们还没有对与PXR结合的相关配基进行研究,因此还需要进一步的实验验证。对CYP450酶的研究已成为新药筛选及评价中药安全性的有力工具。本实验选择了一味临床