光激化学发光免疫分析法快速检测人促卵巢激素

光激化学发光免疫分析法快速检测人促卵巢激素

人体促卵激素（hfsh）从垂体前叶排出，是一种单链酪氨酸酶。hFSH的增高多见于原发性睾丸衰竭、睾丸精原细胞瘤、先天性睾丸发育不全、先天性卵巢发育不全、原发性闭经、原发性性腺功能低下、更年期综合征;其降低常见于女性不孕症、长期服用避孕药、大量应用性激素等。目前血清hFSH的检测,临床上已有时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)、酶标法、磁微粒分离酶联免疫法、放射免疫法、化学发光免疫分析法(CLIA)等。光激化学发光免疫分析法(AlphaLISA)起源于1994年发明的发光氧通道免疫分析(LOCI)技术,其具有高通量、易自动化、省样本、快速简便、敏感性高、标记物稳定、标准曲线范围宽、不受样本自然荧光干扰及无放射性污染等优点。目前广泛应用于临床的是传统的非均相免疫分析,如酶联免疫吸附试验(ELISA)、TRFIA,需要通过洗涤来分离结合标记与游离标记,存在操作过程步骤多、不易标准化及自动化等缺点。本研究采用AlphaLISA研制hFSH定量检测试剂,评价各项性能指标,并与其他检测试剂盒进行比较,评价其在临床检测应用中的可行性。材料和方法一、药品、试剂和仪器2株抗hFSH单克隆抗体购自芬兰Medix公司,hFSH抗原购自Biodesign公司;hFSH国家标准品和质控血清为中国药品生物制品检定所产品;生物素购自于Sigma公司;受体微球、链霉亲和素化的供体微球(Lot:599675-A)为美国PerkinElmer公司产品;96孔微孔板为Packard公司产品;检测仪为美国PerkinElmer公司的2300EnSpireTM检测仪;阴、阳性血清样本各50份来自广州市南方医院;对照试剂盒采用西门子Immulite2000促卵泡生成激素CLIA检测试剂盒。二、方法1.血清hfsh抑制剂溶液配制采用标准品缓冲液[50mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl,7.5%牛血清白蛋白(BSA)、0.9%NaCl、0.05%NaN3、0.01%Tween-20,pH值7.8]将hFSH抗原配制成0、1、4、16、64、192U/L系列参考标准溶液,每瓶1mL分装冻干,4℃保存备用。2.受体微球中pahs的表达将0.2mghFSH包被抗体加入到带有滤膜的离心管中,以5500×g离心5~6min,用标记缓冲液[0.13mol/L,pH值8.0磷酸盐缓冲液(PBS)]重复洗涤6次后,在抗体溶液中加入1mg受体微球、10μL25mg/mLNaBH3CN(用标记缓冲液配制)、1.25μL10%Tween-20,用标记缓冲液将体积补充到200μL,37℃避光振荡反应48h。加入10μL65mg/mL羧甲氧基胺半盐酸盐(CMO,用0.8mol/LNaOH配制)封闭未结合位点,37℃避光温育1h后离心洗涤,得到已连接抗体的受体微球,调整受体微球浓度为5mg/mL。3.抗体最适制备将1mg标记抗体加入到带有滤膜的离心管中,以5500×g离心5~6min。用标记缓冲液(0.1mol/L,Na2CO3/NaHCO3,pH值9.5)重复洗涤6次后,在50μL抗体溶液中加入5μL22mg/mL生物素[用二甲基亚砜(DMSO)配制],室温避光振动孵育4h。利用PBS(pH值7.4)4℃透析24h,6h换液1次,收集透析袋中的液体,并将其抗体浓度调整为0.5mg/mL。4.链霉亲和素化抗体检测将25μL标准品或待检测样本加入微孔板中,并加入以分析缓冲液1∶100比例稀释已连接抗体的受体微球25μL及1∶400比例稀释的生物素化抗体25μL,37℃振动温育15min,然后由仪器自动加入链霉亲和素化的供体微球175μL,37℃振动温育15min后在2300EnSpireTM检测仪上检测信号值。结果一、敏感1.分析敏感性以零参考标准品测定值的均值加上2倍标准差所得的荧光值扣除本底的荧光值,代入标准曲线方程计算所得最小测定值的浓度为0.09U/L。2.hfsh-alas将低值样本倍比稀释后重复10次测定,计算反应量的变异系数(CV),CV>20%时对应的剂量点为0.12U/L,即自制hFSHAlphaLISA检测试剂功能敏感性为0.12U/L。二、特异性1.数据交叉率含250U/L人黄体生成素(hLH)、300mU/L人促甲状腺素(hTSH)和2000U/L绒毛膜促性腺激素(hCG)样本在本试剂的测定值分别为0.41U/L、0.24mU/L和0.35U/L,即交叉率分别为0.16%、0.08%和0.02%。2.血红蛋白、油松、麻黄向已知浓度的血清样本中分别添加血红蛋白、甘油三酯、胆红素干扰物,比较测定浓度值和原始浓度值,结果表明自制hFSHAlphaLISA试剂在检测样本时基本不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。见表1。三、剂量-反应线性关系以自制试剂中参考标准品浓度的对数为横坐标,信号值1×103计数的对数为纵坐标,由双对数数学模型Log-Log函数处理,测得hFSH试剂剂量-反应曲线线性相关系数(r)为0.9995,表明自制AlphaLISA检测试剂具有良好的剂量反应线性关系。见图1。四、试验区域自制hFSHAlphaLISA检测试剂剂量-反应曲线的范围为0.09~192.00U/L。五、准确性评估1.更正时期以hFSH国家标准品为对照品,自制试剂检测国家标准品的偏差值均在0.900~1.100之间,正确度良好。见表2。2.质控品、采用中国药品生物制品检定所提供的低、中、高3个hFSH质控品(质控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,预期浓度分别为5、15、50U/L)进行测定。结果显示,自制试剂的分析内CV和分析间CV分别为4.2%~7.1%和7.5%~8.3%,符合体外诊断试剂检测的要求。见表3。六、返回率测试1.hfsh的添加回收率在5个浓度的hFSH血清样本中添加不同浓度的hFSH纯抗原,使得血清中hFSH的最终期望浓度为150U/L,计算回收率,结果见表4,hFSH的添加回收率在93.7%~105.7%之间,表明添加物与血清待测物一致,基本没有血清基质物的干扰。2.真实浓度和比较测定浓度值对比将3个已知浓度的血清样本用标准品稀释液按1∶4、1∶8、1∶16比例稀释,比较测定浓度值和真实浓度值,结果见表5。hFSH的稀释回收率在95.5%~106.5%之间,表明血清待测物基本没有标准品稀释液基质物的干扰。七、hook-key效应若待测样本浓度高于208U/L将出现Hook效应,结果见图2。八、稳定性自制试剂放置4℃半年、37℃7d后,各批试剂盒信号值变化不大,线性关系良好,且参考标准品A点信号值未见明显升高。九、试剂盒相比较用自制试剂检测血清hFSH的分析敏感性、精确度、稳定性及线性范围的结果,与西门子CLIA检测试剂盒相比较差异均无统计学意义。100份临床血样同时用自制试剂与CLIA试剂进行平行检测,结果显示2种诊断试剂的阳性符合率和阴性符合率均为100%。对所测定的数值进行相关性分析,结果2种方法所得的数值有明显相关性,Y=0.922X-1.444,r=0.979,P<0.001。见图3。种生物分子检测方法的对比AlphaLISA起源于1994年发明的LOCI,是一种通过化学发光检测微球间生物分子相互结合进而测得分析物含量的方法。在680nm的光照下,供体微球中的光敏物质受到激发产生单线态氧,单线态氧扩散至受体微球,与其中的发光物质反应后产生615nm的时间分辨荧光。由于单线态氧在溶液中维持活性的时间很短(约4μs),只能扩散约200nm的距离,因此只有那些通过待测分析物与供体微球连接在一起的受体微球才能发光,而其他游离的受体微球即使存在于检测体系内,也将不会发光,从而可根据发光强度即可得知待测物浓度。二者成双对数线性关系。也就是说,在供体微球和受体微球大大过量的情况下,待测生物分子的量与被连接的2种微球的量呈比例。在激发光源(680nm)的作用下供体微球促使受体微球发光,因此待测生物分子的量与受体微球的发光强度呈比例关系。从该原理可知,该技术无需冲洗游离标记物,与现有的其他检测方法相比较,AlphaLISA因其独特的检测方法,使其具备时间分辨、均相、不需洗涤等突出特点。本研究旨在应用AlphaLISA来定量检测人血清hFSH,自制试剂的分析敏感性为0.09U/L,线性范围为0.09~192.00U/L,不精密度≤8.3%。CLIA检测试剂盒的分析敏感性为0.1U/L,线性范围为0.1~170.00U/L,不精密度<7.9%。TRFIA检测试剂盒的分析敏感性为1.0U/L,线性范围为1.0~256.00U/L,不精密度<8.5%。本研究结果显示,自制试剂与CLI