甲磺酸胺银杏内酯b抗血小板聚集和释放作用研究

甲磺酸胺银杏内酯b抗血小板聚集和释放作用研究

与血栓形成和血栓形成直接相关的血栓活动因素为paf。这是迄今为止发现的最强大的血小板聚集诱导剂。研究表明银杏内酯B(GB)是血小板活化因子特异性受体拮抗剂,然而GB水溶性极小,临床使用受限。为使GB在治疗血栓性疾病方面有更广泛的应用,我们在GB母核上增加新的基团合成衍生物甲磺酸胺银杏内酯B,增加了水溶性,见结构式图。本试验旨在考察甲磺酸胺银杏内酯B对血小板聚集和释放反应的影响,探讨其治疗血栓性疾病的特点及作用机制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1药物、试剂和仪器甲磺酸胺银杏内酯B,白色结晶(纯度>98%,分子量为591.63g/moL),由南京柯菲平医药科技有限责任公司提供,用生理盐水配制。银杏内酯B(GB),白色结晶(分子量为424.4g/moL),购自合肥标品生物技术有限公司,用二甲基亚砜配制。曲克芦丁注射液:天津药业焦作有限公司。血小板活化因子(PAF):SIGMA公司。钙离子指示剂Fluo-3-AM:Ivitrogen公司。TXB2放免试剂盒,6-keto-PGF1α放免试剂盒,购自北京华英生物技术研究所。其余试剂均为国产AR级。1.1.2动物♂性新西兰家兔,由南京江宁县汤山青龙山动物繁殖场提供,实验动物生产许可证:SCXK(苏)2002-0027。1.1.3血小板聚集及血凝仪测定FA-2104上皿电子天平(上海精科天平)。LDZ5-2离心机(北京医用离心机厂)。XSP-13型光学显微镜(南京江南光学仪器厂)。PAPER-I型血小板聚集及血凝测定仪(北京世帝科学仪器公司)。ZT-Ⅲ多头细胞样品收集器(上海跃进医疗器械厂)。SpectraMaxue5f8GeminiXS微孔板荧光检测仪(MolecularDevices公司)。DFM-96型16管放射免疫γ计数器(合肥众成机电技术开发有限责任公司)。1.2实验方法1.2.1血小板prp测定取♂性家兔48只,体重2.0~2.5kg,随机分为6组:(1)对照组:0.9%氯化钠注射液。(2)曲克芦丁组:24mg/kg。(3)GB组:3.90mg/kg。(4)甲磺酸胺银杏内酯BⅠ组:1.95mg/kg。(5)甲磺酸胺银杏内酯BⅡ组:3.90mg/kg。(6)甲磺酸胺银杏内酯BⅢ:7.80mg/kg。耳缘静脉连续给药5d,给药容积均为0.5mL/kg。末次给药15min后颈总动脉取血,用3.8%柠檬酸钠抗凝,血液与柠檬酸钠容积之比为9∶1。800r/min离心10min后吸取上层血浆即得PRP。将剩余血液2500r/min离心10min后吸取上层血浆即得贫血小板血浆(PPP)。对PRP进行计数,若血小板浓度较高,则用PPP稀释至360×109/L。先用250μLPPP进行定标,然后取250μLPRP加入测试杯中,在37℃预温槽中预热1min后放入测试孔,按“开始”键时立即加入诱导剂0.01mg/mLPAF10μL,测定最大聚集率,每只家兔同时测定4个测试孔取均值。用公式计算血小板聚集抑制率。1.2.2甲基丙烯酸酯b对paf诱导寄生虫释放的影响各组末次给药后15min取血,制备PRP和PPP,进行血小板计数。1.2.2.混悬血小板的制备(1)Flou-3-AM导入血小板:在4mLPRP中加入4μLFlou-3-AM(Flou-3-AM用DMSO溶液配成1mg/mL)置37℃30min,用Hepes缓冲液洗涤二次(800r/min离心10min,加入等体积Hepes缓冲液进行冲洗),混悬血小板(浓度大约为150×109/L)在Hepes缓冲液中待测。(2)荧光测量:取上述负载Flou-3血小板悬液在荧光分光光度计上测定光强度(激发波长为505nm,发射波长530nm),计算血小板[Ca2+]i。1.2.2.txb2和6-keto-pgf1水平放射免疫法(RIA)测定PAF诱导家兔血小板中TXA2和PGI2含量。由于TXA2和PGI2在37℃下性质不稳定,很快水解为稳定的代谢产物TXB2和6-keto-PGF1α,因此可测定TXB2和6-keto-PGF1α的含量来反映TXA2和PGI2的水平。取血小板数为360×109/LPRP500μL,加20μL0.01mg/mLPAF反应5min后,立即加入20μL10μmol/L消炎痛终止反应。然后离心(1200r/min,5min),取上清400μL于-20℃保存,按RIA试剂盒说明书测定TXB2和6-keto-PGF1α含量。2结果2.1对paf诱导的家兔血小板聚集率的影响甲磺酸胺银杏内酯B1.95、3.90、7.80mg/kg3个剂量组、GB3.90mg/kg组和曲克芦丁24mg/kg组对PAF诱导的家兔血小板聚集率有抑制作用,与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01)。见表1。2.2甲基丙烯酸酯b对paf诱导寄生虫释放的影响2.2.1组血小板释放ca2+、空白对照率的影响甲磺酸胺银杏内酯B1.95、3.90、7.80mg/kg3个剂量组对PAF诱导家兔血小板释放Ca2+均有抑制作用,在激发后10min内与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01)。曲克芦丁(24mg/kg)和GB(3.90mg/kg)对PAF诱导家兔血小板释放Ca2+有抑制作用,与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01)。见表2。2.2.2甲磺酸胺银杏内b7的影响甲磺酸胺银杏内酯B1.95、3.90、7.80mg/kg3个剂量组对PAF诱导家兔血小板释放TXB2有抑制作用,并可降低TXB2/6-keto-PGF1α比值,其中甲磺酸胺银杏内酯B7.80mg/kg剂量组与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05)。见表3。3甲磺酸胺银杏内酯b的生理作用实验结果表明,甲磺酸胺银杏内酯B对PAF诱导的家兔血小板聚集有抑制作用,能减少血小板释放Ca2+、TXB2,降低TXB2/6-keto-PGF1α比值。以上研究中,我们选取了曲克芦丁和GB这两个阳性对照药。既住研究发现,曲克芦丁体内给药对PAF、ADP、AA、COL有抑制作用。曲克芦丁系芦丁经羟乙基化制成的半合成黄酮化合物,能够增加红细胞和血小板表面电荷密度,抑制红细胞和血小板聚集,加强体内纤维蛋白溶解活性。而GB是甲磺酸胺银杏内酯B的前体药物,在血小板聚集和释放反应中,甲磺酸胺银杏内酯B与GB具有相似的药理活性,均能抑制血小板聚集,抑制血小板释放Ca2+、TXB2等活性物质。由于甲磺酸胺银杏内酯B增加了水溶性,若作为新药注射液开发具有一定的市场前景。Ca2+是血小板代谢与功能的一个重要因子,它参与血小板激活的许多重要环节,包括形状变化、聚集和释放。细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的平衡主要由细胞内钙释放和外钙内流决定。细胞内钙释放的调节有两个最经典的通道,三磷酸肌醇(IP3)信号调节通路和Ryanodine信号调节通路。本研究中,PAF激活膜磷脂酶C,催化磷脂酰肌醇水解,产生二脂酰甘油和三磷酸肌醇促使Ca2+由血小板内的致密管道系统释放,并促使Ca2+内流导致血小板内游离Ca2+浓度升高进而触发其聚集和释放功能,使血液循环障碍进一步发展。甲磺酸胺银杏内酯B可以抑制对PAF诱导的家兔血小板释放Ca2+。由于GB是PAF受体特异性拮抗剂,因此推测,甲磺酸胺银杏内酯B可能通过竞争性抑制PAF与PAF受体的结合,从而降低PAF诱导家兔血小板Ca2+的释放。TXA2是血小板活化的强诱导剂,也是一种致血管收缩和平滑肌细胞分裂的生物活性物质。主要由血小板合成,但也可以由单核细胞和血管平滑肌细胞(VSMCs)合成。PGI2是