血清中胰岛素光激化学发光免疫分析的方法研究

血清中胰岛素光激化学发光免疫分析的方法研究

胰岛素（i）是胰岛素细胞产生的一种可溶性蛋白质激素，由两条氨基酸糖链组成。a链21个氨基酸，b链30个氨基酸。a-b链通过两条二级硫化合物连接。相对分子质量大约为6000,是人体内唯一的降糖激素,同时可促进糖原、脂肪、蛋白质合成。测定血清中INS的含量,对胰腺β细胞质量与生理功能、糖尿病(DM)、胰岛素瘤、胰岛素抵抗综合征(IR等相关疾病的鉴别诊断、病情监测及疗效观察有重要作用。INS检测方法除了早期的放射免疫法(RIA)、酶联免疫法(ELISA)外,近年化学发光法和时间分辨免疫分析法在临床应用和基础研究中也被广泛使用,但是这些方法都是非均相测定,操作过程复杂,需要不断的分离和洗涤。光激化学发光技术因其独特的检测方法,实现了均相测定,免清洗,操作快速简便。本研究采用该新型标记免疫分析技术,同时运用双抗体夹心法快速检测血清中INS的含量,评价试剂的各项性能指标并与其他检测INS试剂盒比较,评价其应用于临床检测的可行性。1材料和方法1.1供体微球、链霉亲和素化抑制剂和仪器两株配对INS单克隆抗体和INS抗原购自美国Biodesign公司;生物素购自于sigma公司;受体微球、链霉亲和素化的供体微球为美国PerkinElmer公司产品;96孔微孔板为美国PerkinElmer公司产品;检测仪为美国PerkinElmer公司的2300EnSpireTM检测仪。125份血清样本来自广州达安基因临检中心。1.2u/ml反应体系稀释INS抗原至浓度分别为0、3.6、14、75、180μU/ml系列浓度,稀释液为含50mmol/LTris-HCl,1.5%BSA、0.9%NaCl、0.05%NaN3、0.01%Tween-20,pH7.8的反应缓冲液。1.3体外抗体反应时间的制备将0.2mgINS抗体加入Millipore公司的带有滤膜的离心管中,以9000r/min离心8min,用缓冲液(pH6.2,0.05mol/LMES溶液)重复洗涤6次后收集抗体,在抗体溶液中加入1mg受体微球、10μl25mg/mlNaBH3CN(用缓冲液配制,现配现用)、1.25μl10%Tween-20,而后用缓冲液将体积补充到200μl,37℃避光振荡反应48h。最后加入10μl65mg/mlCMO(用0.8mol/LNaOH配制,现配现用)37℃避光孵育1h封闭未结合位点,离心洗涤,得到已连接抗体的受体微球,调整受体微球浓度为5mg/ml。1.4抗体溶液的制备将0.4mg抗体加入到Millipore公司带有滤膜的离心管中,以9000r/min离心8min,每次用200μl缓冲液(0.1mol/LNa2CO3/NaHCO3,pH9.5),重复洗涤6次后收集抗体,调整抗体浓度为20mg/ml。在抗体溶液中加入2μl22mg/ml生物素(用DMSO配制,现配现用),室温振动孵育4h。将连接产物加入到Millipore公司带有滤膜的离心管中,9000r/min离心8min,每次用200μl缓冲液(PBS+0.01%NaN3,pH7.4),重复洗涤6次后收集抗体,并将其抗体浓度调整为1mg/ml。1.5检测信号值的测定将25μl标准品或待检测样品加入微孔板中,并分别加入以分析缓冲液1∶50比例稀释的已连接抗体的受体微球25μl、1∶400比例稀释的生物素化抗体25μl,37℃振动孵育15min,然后在避光条件下加入链霉亲和素化的供体微球175μl,37℃振动孵育15min后在2300EnSpireTM检测仪上检测信号值。2结果2.1光激化学发光免疫检测试剂的剂量反应采用LIN-MEAS拟合模式,绘制INS试剂标准曲线如图1。在测量范围内,自制试剂剂量-反应曲线方程为Y=1.24X+1.91,相关系数r=0.975,表明自制INS光激化学发光免疫检测试剂具有良好的剂量反应。2.2加标回收率实验在一份浓度为4μU/ml(用自制试剂检测)的正常血清中,分别等体积加入浓度为3.6、14、180μU/ml的低、中、高浓度的标准品,制成3个待测样品,进行回收率实验。结果显示回收率为95.6%～107.9%,提示该试剂测试准确度较高,能满足临床需求(表1)。2.3精密度的测定以零参考标准品测定值(n=20)的均值加上2倍的标准差后得到信号值,代入标准曲线方程计算得分析灵敏度,即检测下限为0.753μU/ml。将INS配制成一系列浓度进行测定,在0～180ng/ml范围内未出现HOOK效应,因此标准曲线的线性范围为0.753～180μU/ml。2.4精密度实验用自制低中高3个质控品,各设10个复孔,同一次实验内和不同实验中多次测定。自制试剂分析内变异系数为7.46%～9.74%,分析间变异系数为5.24%～7.31%,精密度良好(表2、表3)。2.5特异性将一定浓度的C肽、胰岛素原作为样品用自制INS试剂测定,结果见表4。2.6稳定实验自制试剂37℃放置7d后,各批试剂信号值变化不大,线性关系良好,且参考标准品A点信号值未见明显升高。2.7血药浓度与临床血样检测方法的相关性分析对临床阴、阳性血清标本各40份,用自制INS光激化学发光免疫分析试剂进行测定,结果显示,40份阳性血清中40份为阳性;40份阴性血清中39份为阴性,检测的灵敏度和特异性分别为99%和98%。125份临床血样同时用自制试剂与ECLIA进行平行检测,对所测数值进行相关性分析结果显示2种方法所得的数值有显著相关性,AlphaLISA=0.560ECL+0.773,r=0.983,P<0.001(图2)。比较常用方法的检测性能(表5),可以看出光激化学发光免疫分析试剂在检测性能指标上与电化学发光免疫分析试剂盒、时间分辨荧光免疫分析试剂盒无明显差异。3血清中in的检测方法血清胰岛素检测是临床上常用的胰岛分泌功能的检测方法,是反映胰岛β细胞贮备和分泌功能的重要指标。对于新近确诊的糖尿病人,胰岛素检测有助于糖尿病的分型,指导临床治疗,还对预测高危人群是否发生糖尿病有重要参考价值。血清中INS常用检测方法有放射免疫法,酶联免疫法,化学发光免疫法,电化学发光免疫法及时间分辨免疫法。早期使用的放射免疫法灵敏度低,存在放射性污染,且血清中有胰岛素抗体,更影响了INS的放射免疫法检测准确度。酶联免疫法只能定性或半定量,不满足临床的定量需求,且灵敏度也低,操作繁琐,需洗板。化学发光不能重复测量,检测试剂为非开放性试剂,成本高。时间分辨免疫法操作繁琐,需要反复分离和洗涤,耗时长。本文应用AlphaLISA定量测定血清INS含量。AlphaLISA技术是一种通过化学发光检测微球间的结合,进而定量检测分析物含量的方法。在680nm的光照下,供体微球中的光敏物质受到激发产生单线态氧,单线态氧扩散至受体微球,与其中的发光物质反应后产生615nm的化学发光。由于单线态氧在溶液中维持活性的时间很短(约4μs),只能扩散约200nm的距离,因此只有那些通过待测物质连接在一起的受体微球和供体微球才能产生化学发光。由于该技术采用的受体微球和供体微球均为纳米级微球,增加了反应表面积,且联合运用了生物素-链霉亲和素放大系统使检测灵敏度极高,可达attomole(10-17摩尔/孔)水平。另外检测过程中单线态氧的能量传递不易受到样本常见干扰物质、pH值、离子强度及温度等因素的影响,保证了检测稳定性与可重复性,减少了偶然误差。此外AlphaLISA技术还具有省样本(低至5μl)、线性范围宽、时间分辨能力强、无放射性污染及应用广泛等优点。本研究采用AlphaLISA技术,制备了血清中INS定量检测试剂。实验结果显示自制试剂分析灵敏度,线性范围,精密度与罗氏电化学发光INS检测试剂盒无明显差别。特异性实验结果显示和胰岛素原有轻微交叉反应,与C肽无明显交叉反应,说明该试剂可用于临床准确定量检测血清中INS含量。自制INS检测试剂的阳性阈值定为18μU/ml,稍低于电化学发光的24.1μU/ml,这可能与不同检测方法的方法学性能存在差异有关。稳定性试验表明自制试剂37℃可以保存7d左右,标准曲线无明显漂移。12