免疫共抑制分子pd-1的基因克隆及功能研究

免疫共抑制分子pd-1的基因克隆及功能研究

根据t细胞激活的“双信号”模型，t细胞的有效激活和影响功能不仅来自mcl-tr组合的第一信号，还来自具有表面共刺激（apc）的共启动细胞（apc）的第二信号（即辅助信号）。缺乏共刺激的抗原刺激易引发T细胞的无应答、耐受及细胞凋亡。PD-1最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆,其结构类似于CD28分子。随后的研究表明PD-1的表达与细胞凋亡无关但与淋巴细胞活化相关。PD-1基因敲除小鼠可自发诱导多种自身免疫性疾病,表明PD-1是一种重要的免疫抑制分子并在外周耐受中发挥着重要的作用。因此,以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及诱导器官移植存活等均有重要的意义。现对这一分子的功能及研究进展进行综述。1共刺激产物的表达1992年Ishida等最先从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆到了小鼠的PD-1基因。人PD-1基因位于染色体的2q37.35,为Mr55000的跨膜糖蛋白,其与小鼠PD-1蛋白在氨基酸组成上有60%的同源性。虽然PD-1被认可为CD28超家族成员,但PD-1蛋白质结构与CD28、CTLA-4及ICOS存在明显差异,具体表现为:(1)PD-1缺乏介导CD28/CT-LA-4与B7.1/B7.2相结合的MYPPPY序列,也缺乏介导ICOS与ICOS-L相结合FDPPPF序列,因此,其与配体的结合非常特异,而不与其他的B7家族分子产生交叉结合。(2)与其他共刺激分子以二聚体形式存在不同,PD-1胞外区缺乏半胱氨酸残基,因此PD-1可以单体的形式存在。与其他的共刺激分子仅表达于T淋巴细胞不同,PD-1持续性表达于T、B淋巴细胞、骨髓细胞并上调于活化的T细胞表面。因此,PD-1信号主要调节活化及效应期的淋巴细胞功能。PD-1胞内含有两个酪氨酸(小鼠的Y225及Y248,人的Y223及Y248)残基,靠近N端和C端的酪氨酸与临近的氨基酸分别组成ITIM样基序(小鼠的VAYEEL基序及人的VDYGEL基序)及ITSM基序(小鼠及人的都为TEYATI)。当PD-1/BCR或PD-1/TCR交叉连接时,PD-1的ITIM基序可招募胞内的SHP-2并磷酸化Igα、Syk,及其他下游的蛋白,降低BCR或TCR受体信号,最终抑制淋巴细胞的增殖及细胞因子的产生并诱导细胞分裂周期停滞。2-h和b7-1、7-2和b7-2对小鼠b7-2和b7h-2的同源性表达PD-1的两个配体PD-L1及PD-L2已被不同的研究小组鉴定,并分别称为B7-H1及B7-DC。二者都为I型跨膜糖蛋白,属于B7家族成员。其膜外区有免疫球蛋白的V样及C样结构并存在30个氨基酸组成的跨膜区及几个氨基酸的细胞质尾。人B7-H1与B7-1,B7-2及ICOS的同源性约为21至23%。而小鼠的B7-H1与人B7-H1有69%同源性,小鼠B7-H1与B7.1、B7.2及B7h/B7RP-1的同源性约为19%。与其他的B7家族成员仅表达于造血细胞不同,PD-L1可上调表达于活化的T细胞、B细胞、DC、巨噬细胞、单核细胞,或经IFN-γ刺激的角质细胞、内皮细胞及成肌细胞表面。此外,PD-L1也低水平的表达于非淋巴器官如心脏、胎盘、骨骼肌、肺、肝、脾及胸腺等器官。而PD-L2表达仅局限表达于造血系统来源的细胞如树突细胞、巨噬细胞、单核细胞并上调表达于活化的T细胞、B细胞及其他组织来源的免疫细胞表面。B7-H1与B7-DC不同的表达方式表明B7-H1在维持外周耐受发挥主要作用而B7-DC主要是在淋巴结的免疫应答中有重要的功能。3pd-1和疾病3.1pd-1与自身免疫脑脊髓炎现有的研究表明,PD-1基因敲除小鼠可引发多种自身免疫性疾病。如:C57BL/6基因背景的PD-1基因敲除小鼠发育有狼疮样肾小球肾炎及致死的扩张型心肌病。而B6-PD-1-小鼠与H-2Ld特异的2C-TCR小鼠杂交后产生的H-2b/d小鼠(2CTCRTgxH2bxdxPD-1-/-)可导致自发的移植物抗宿主疾病。PD-1的表达也与各种自身免疫性疾病的发生及发展相关。对试验性自身免疫脑脊髓炎(EAE,是一种由自身抗原特异性的T细胞活化诱发的一种自身免疫性疾病)的研究显示,采用髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)免疫EAE小鼠后,其中枢神经系统(CNS)上调表达PD-1及其配体PD-L1,使用PD-1阻断性抗体产生免疫后可导致抗原特异性的T、B细胞繁殖、活化及炎症细胞因子的产生而增强迟发型超敏反应,表明PD-1参与EAE的调节;Ansari等研究表明阻断PD-1/PD-L1信号途径可加速NOD小鼠产生糖尿病,表明增强PD-1共刺激信号有可能在糖尿病的免疫治疗中有重要的应用前景;Prokunina等采用用单核甘酸多态性分析(SNPs)表明PD-1一个内含子SNP的等位基因改变与欧洲及墨西哥人群高频率系统性红斑狼疮(SLE)的发病相关;Achi等分析44个RA及6个骨关节炎(OA)患者滑液及外周血T细胞PD-1表达,结果表明RA患者滑液中T细胞高表达PD-1。细胞因子分析表明CD4+PD-1+细胞分泌高水平的IL-10而较少的IL-2,表明PD-1+CD4+T细胞是RA患者的滑液中独特的无反应性T细胞亚型。3.2pd-l1与糖尿病阳性及阴性T细胞共刺激信号的平衡对调节T细胞的活化尤为重要。阻断CD28,CD154(CD40L)或二者被证明有效的阻止某些模型的急性同种异体移植物排斥反应。PD-1途径也可诱导移植耐受。Cao等研究表明皮肤移植的供者上皮细胞表达PD-1配体-B71-H1可诱导T细胞分泌抑制性细胞因子IL-10并诱导局部免疫耐受;Gao等研究分析刺激PD-1阴性信号结合阻断CD154共刺激信号有利于胰岛异体移植物耐受的诱导。在胰岛移植小鼠模型中,受者C57BL/6(H-2b)小鼠在接受DBA/2(H-2d)来源的小岛细胞后在PD-L1Ig及anti-CD154处理下可诱导长时间的存活。表明PD-1在排斥反应中发挥着关键的抑制功能。然而,PD-1/PD-L1相互作用阻止自身免疫性糖尿病的发生及诱导针对移植后β-细胞的T细胞耐受的准确机制尚未清楚,一种假说是没有足够的PD-L1表达于胰脏的局部环境中,例如小鼠及人的胰脏组织都缺乏PD-L1及PD-L2蛋白的表达,因而没有足够PD-1信号与糖尿病的发生及移植接受者胰岛的排斥相关。因此,PD-L1可能在I型糖尿病的治疗中有重要的作用。Ozkaynak等分析了PD-1及其配体在实验性心脏同基因移植排斥中的表达及功能。在最初的研究,多数正常的组织及心脏同基因移植极少表达PD-1,PD-L1,或PD-L2,但心脏同种异体移植排斥中可诱导3个分子的表达。在环孢霉素A或雷怕霉素治疗下同种异体移植物仍可表达该3种分子。但在抑制后早期阻断CD154或抗ICOS单抗可其表达。体外分析表明PD-L1.Ig及PD-L2.Ig融合蛋白可结合并抑制活化的PD-1+T功能,体内分析表明单独的PD-L1.Ig或PD-L2.Ig都不能调节同种移植排斥,然而,PD-L1.Ig可抑制CD28-/-受者的排斥反应。此外,PD-L1.Ig也可显著延长心脏同基因移植的存活,表明PD-L1.Ig可诱导移植耐受并显示较好的临床利用前景。3.3阻断pd-1信号PD-1信号通路也参与病毒性及微生物感染性疾病的进程。在LCMV慢性感染的小鼠体内发现病毒特异性的细胞毒性T细胞(CTL)为PD-1阳性,而在急性感染模型中,并没有发现这群细胞。进一步的实验证实这群PD-1阳性的CTL位于记忆性的T细胞并具有活化标志,但不能分泌IFN-γ及穿孔素等抗病毒效应分子,表现出“功能衰竭”的特征。随后在HIV、HCV及HBV慢性感染患者体内都发现了这类PD-1阳性的功能衰竭性CTL,此外,PD-1的表达与病毒载量呈正相关。而阻断PD-1信号则可逆转CTL的“功能衰竭”状态并清除病毒。表明PD-1可作为HIV等慢性感染性疾病的治疗靶标。令人兴奋的是,最近在人源化的BLT小鼠身上发现,阻断PD-1信号可促进针对HIV病毒特异性的细胞及体液免疫。此外,在恒河猴的模型中,发现阻断PD-1信号可促进针对SIV病毒特异性的细胞免疫及抗体的产生。这些结果都证实阻断PD-1信号有可能应用于HIV等病毒感染的临床治疗。虽然在慢性HBV感染患者的外周血T细胞中发现有PD-1的上调表达,但是,其是否与慢性感染引起的肝损伤有关尚未明确。最近我们实验室的对32例慢性HBV感染患者及4例正常健康者的对比研究结果显示,慢性HBV感染患者肝脏内的PD-1及其配体PD-L1显著上调表达(图1)。PD-1/PD-L1表达与肝炎症程度及ALT水平相关。此外,在活动期患者肝脏的Kupffer细胞及内皮细胞表面有中等程度的PD-L1表达,而非活动期患者低水平的PD-L1表达,而PD-L1的表达与HBV病毒的载量相关。我们的研究结果提示,PD-1在慢性HBV感染中具有双重的调节功能,即可调节针对HBV病毒的免疫应答同时也可抑制免疫诱导的肝损伤。3.4pd-1和b7-h在免疫抑制作用方面的表达PD-L表达于各种肿瘤组织,而应用PD-1及PD-L的阻断性抗体可增强T细胞应答。表明可通过诘抗PD-L/PD-1途径治疗肿瘤。此外,在小鼠肿瘤模型中,小鼠预先移植PD-L1+肿瘤细胞后,主动转染肿瘤特异性的CD8+T细胞可见其体内该细胞的数量较PD-L1-的少。表明肿瘤组织表达PD-L1可影响CTL的功能。此外,主动输入肿瘤特异性的CD8+T细胞可抑制PD-L1-/B7.1+而非PD-L1+/B7.1+肿瘤的生长,表明在体内,若CD8+T细胞也表达PD-L1,针对B7.1+肿瘤的强大的CD8+T细胞的应答将受到抑制。由于PD-1具有免疫抑制功能,提示其可能在肿瘤的免疫逃逸中发挥着重要的作用。为了证实该假设,早期Dong等分析表明人肺癌(20/21)、卵巢癌(1/3),直肠癌(10/19)及黑色素癌(22)等组织中表达B7-H1。而Yamazaki等研究表明小鼠的多种T、B淋巴瘤细胞系及肾癌、黑色素瘤细胞、成神经瘤细胞及纤维肉瘤等绝大多数肿瘤细胞系都表达B7-H1而仅MBL-2,BAL17表达B7-DC。进一步的研究表明,B7-H1中和性抗体阻断B7-H1途径可增强IFN-γ阳性的T细胞而降低IL-10阳性T细胞来抑制NOD-SCID小鼠肿瘤增长。Sabine等分析表明人恶性神经胶质瘤细胞高表达B7-H1并可下调自身反应性的CD4+、CD8+T细胞产生IFN-γ、IL-2表明参与肿瘤的免疫逃避。Strome等进一步的研究显示,在其收集的人头颈癌标本(SCCHN)中,66%表达PD-1配体分子B7-H1。进一步的小鼠荷瘤模型发现,将B7-H1质粒转染SCCV癌细胞,并将这群细胞输入小鼠体内建立肿瘤模型。主动的T细胞免疫治疗不能挽救小鼠的死亡,但使用B7-H1的中和性抗体结合T细胞治疗可使60%的小鼠成活。表明阻断B7-H1可有效的辅助T细胞治疗。我们实验室也分析了PD-1配体B7-H1及B7-DC在人乳腺癌中的表达,在所收集的77例临床标本中,发现这些标本都有不同程度的B7-H1及B7-DC的阳性细胞(图2)。尤其在低分化的小叶癌表达最为显著。我们的5年随访发现,B7-H1的表达与患者的预后呈负相关(尚未发表)。因此,我们的研究结果也证实,B7-H1/PD-1信号参与了肿瘤的免疫逃避。4pd-1抑制剂目前我们对共刺激分子B7-H1/PD-1有了一定的认识,但