sz诱导的糖尿病大鼠胰岛细胞损伤与白细胞inos-mrna表达的关系

sz诱导的糖尿病大鼠胰岛细胞损伤与白细胞inos-mrna表达的关系

糖尿病也被称为多酚糖尿病，也称为多酚糖尿病（idd）。早期病理改变是由胰岛上的单个白细胞浸润引起的炎症反应。研究显示,这种炎症反应引起的β细胞损伤及胰岛素分泌衰竭与巨噬细胞释放白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(tumornecrosingfactor,TNF)等,介导诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)表达有关。祁忠华等曾测过实验动物血浆一氧化氮(nitricoxide,NO)代谢物浓度和内脏器官中iNOS-mRNA表达。但用原位杂交技术检测外周血白细胞iNOS-mRNA表达的研究尚未见报道。本实验通过对STZ诱导的糖尿病大鼠模型胰岛β细胞功能及外周血白细胞iNOS-mRNA表达关系,来探讨NO-iNOS-mRNA信号途径在糖尿病发病中的作用。材料和方法1材料表面1.1动物和小组雌性Wistar大鼠,体重(200±10)g,由本校实验动物中心提供。普通饲料喂养。随机分为对照组10只,实验组15只。1.2试剂原位杂交试剂盒由武汉博士德公司提供;血糖试纸为美国产稳捷系列试纸条;一氧化氮测试盒由南京建成公司提供。1.3仪器美国稳捷系列血糖仪;北京产752紫外分光光度计。2血糖、血浆胰岛素水平检测实验组给予链脲佐菌素(streptozocin,STZ)50mg/kg腹腔注射,诱导糖尿病发病,饲养3周。于实验前、3d、1周、2周、3周尾静脉取血测定血糖、血浆胰岛素,并分离外周血白细胞;实验结束时,取肝、肺等组织,冰冻切片。2.1输注后人源中白领的表达严格无菌操作,尾端取血0.5mL,肝素抗凝,置DEPC水处理的无菌0.5mLEP管,室温静置2h,取上层富含白细胞的血浆0.2mL,置1mLEP管中,加入4%多聚甲醛1mL固定3h,4000r/min,离心5min,弃上清;0.05mol/LPBS1mL洗涤沉淀2min,4000r/min,离心5min,弃上清,重复3次;0.05mol/LPBS0.2mL混匀沉淀,吸取白细胞混悬液20μL,涂片,37℃干燥过夜,按原位杂交流程检测白细胞iNOS-mRNA表达(探针由搏士德公司提供,为大鼠动脉内皮细胞源iNOS35个碱基的寡核苷酸三项探针)。核固红复染,镜检,计算白细胞阳性细胞率。2.2肝肺组织的原状混合随机取模型组5例大鼠的肝脏和肺组织,4%多聚甲醛固定16h,冰冻切片,按原位杂交流程检测iNOS-mRNA表达。2.3血液测试取全血1大滴,置血糖试纸条,稳捷系列血糖仪显示结果。2.4胰岛素法采用放免法,试剂盒购自北京北方生物技术研究所,检测仪器为瑞典LKB公司生产的γ-计数器。2.5氧气氮测定鼠尾端取血,用Griess试剂比色法,于550nm波长下比色,测定NO代谢产物NO-2含量。3值标准差表示血糖、血浆胰岛素、血NO-2含量以平均值±标准差(x¯±s)表示,组间比较采用t检验。外周血白细胞iNOS-mRNA表达,用阳性原位杂交细胞百分率反映。结果1两组造型前后比较造型3d后,实验组15只动物血糖显著高于对照组(>13.8mmol/L),1、2、3周时仍持续升高,与对照组及造型前比较差异显著,P<0.01(见表1)。2血浆胰岛素造型3d后,实验组15只动物血浆胰岛素水平显著低于对照组(P<0.01),1、2、3周时仍持续降低(见表2)。3mol1.2.3.4.3.4造型1周时,实验组NO2-含量为(5.48±3.22)μmol·L-1,显著高于对照组(0.99±0.80)μmol·L-1,P<0.01。4造型1周时细胞阳性率对照组10例外周血白细胞无iNOS-mRNA表达,实验组表达显著高于对照组。造型1周时白细胞阳性率为(38.2±5.4)%;2周(39.8±8.2)%;3周时为(37.7±4.4)%(图1,见加页Ⅳ)。5肝和肺组织中白细胞的内囊mrna显示对照组未见iNOS-mRNA表达,实验组可见肝、肺组织中的白细胞有阳性表达(图2,见加页Ⅳ)。nos在侵权检测中的作用研究表明,STZ糖尿病大鼠模型的胰岛损伤和胰岛素分泌衰竭与大量NO产生有关;同时发现该模型的单核细胞释放IL-1、TNF等细胞因子增加。学者们针对IL-1诱导胰岛损伤的问题通过细胞培养进行了大量细致工作,所得结果一致,即IL-1处理胰岛组织可使糖刺激诱发的胰岛素分泌量显著减少。Corbett等观察到IL-1对胰岛β细胞的损伤在于iNOS表达增强引起的NO产生过多。Stassi等观察了IL-1处理的正常人胰岛β细胞表面受体Fas表达的变化,结论是NO可诱导Fas表达,进而诱导胰岛β细胞的凋亡。总之,胰岛β细胞的损伤过程中,NO是重要的介导因素。NO是调节多种生理及病理生理过程的重要介质。已明确,源于原生型NOS(cNOS)的NO主要调节多种生理功能;而源于诱导型NOS(iNOS)的NO,生理情况下极少表达,当存在诱导因素而被激活时,常表现为NO的持续大量生成,并主要介导多种病理生理过程。Loren等认为,巨噬细胞激活后释放的NO是多种疾病发生的中心环节,近几年NO-iNOS这一信息通路已成为研究热点。iNOS主要由单核-巨噬细胞系统及血液粒细胞表达,当其表达增强时,外周血白细胞上应该有其相应变化。本实验除了观察STZ糖尿病大鼠模型的血糖和胰岛素变化外,并发现了外周血白细胞iNOS-mRNA表达的明显增强。全身用药复制STZ糖尿病模型,对胰岛β细胞的损伤已较肯定,本研究显示该模型的外周血白细胞iNOS-mRNA表达明显增强。同时我们分别检测了实验组和对照组各5例肝、肺组织中iNOS-mRNA的表达,发现实验组肝、肺组织中的吞噬细胞有阳性表达(图2,见加页Ⅳ),而对照组全部呈阴性反应,我们认为肝、肺组织中这些iNOS-mRNA阳性细胞来自于血液,反映STZ糖尿病大鼠可能存在着全身性单核-巨噬系统iNOS-mRNA表达增强的情况。胰岛以外组织中单核-巨噬系统iNOS-mRNA表达增强对糖尿病的发生发展产生何种作用,尚待探讨。白细胞样品容易获得,进行原位杂交时样品的处理简便,结果也容易定量,可用白细胞阳性百分率表示。本实验为进