纤维素酶活性的测定

纤维素酶活性的测定一、目的要求了解纤维素酶的组成特点，学习果蔬组织中粗纤维酶活性测定原理和方法。二、基本原理在纤维素酶（Cellulase）作用下，纤维素可被逐步水解并最终生成β-葡萄糖。纤维素结构复杂，没有任何一种酶能将它彻底水解。纤维素酶是一种多组分酶（C1-Cx），可分为三种不同组分：（1）C1酶是一水解因子，作用于天然纤纤维素的结晶区（棉花纤维为高度结晶性纤维），使氢键破裂，呈无定形可溶态，成为长链纤维素分子。（2）Cx酶通常包括：内切葡萄糖苷酶（endo-β-1,4-D-glucanase）。这类酶随机水解β-1,4-糖苷键，将无定形长链纤维素分子（羧甲基纤维素钠为人工合成的一种线形纤维素钠盐）截短。外切葡萄糖苷酶（exo-β-1,4-D-glucanase），又称纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase，CBH）。这类酶作用于β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。（3）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase），这类酶将纤维二糖（水杨苷为葡萄糖苷键连接的纤维二糖）水解成葡萄糖分子。在碱性条件下，纤维素酶催化纤维素水解的产物纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原。通过测定纤维素酶催化形成还原糖的量可测定纤维素酶的活性。三、材料、仪器及试剂（一）材料苹果、梨、香蕉等。（二）仪器及用具恒温水浴锅、分光光度计、电子天平、试管、移液管或加液器、具塞刻度试管（25mL）、容量瓶（100、1000mL）、烧杯等。（三）试剂1．50mmol/L、pH5.5醋酸钠缓冲液母液A（0.2mol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000mL。母液B（0.2mol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、稀释至1000mL。取6.8mL母液A和43.2mL母液B混合后，调节pH至6.0，稀释至200mL。2．提取缓冲液（含1.8mol/LNaCl）称取10.5gNaCl，用50mmol/L、pH5.5醋酸钠缓冲液溶解、稀释至100mL，摇匀。3．50mmol/L、pH5.0柠檬酸缓冲液母液A（0.1mol/L柠檬酸溶液）：称取21.01gC6H8O7·H2O，溶解、稀释至1000mL。母液B（0.1mol/L柠檬酸钠溶液）：称取29.41gNa3C6H5O7·2H2O，溶解、稀释至1000mL。取20.5mL母液A和29.5mL母液B混合，调节pH值至5.0，稀释至100mL。3．3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂参照DNS试剂测定还原糖实验中的方法配制。4．1%羧甲基纤维素钠（CMC）溶液准确称取1.00g羧甲基纤维素钠，用50mmol/L、pH5.0柠檬酸缓冲液加热溶解后转移到100mL容量瓶中，待冷却后，用该缓冲液定容至刻度，4℃保存备用。四、实验步骤（一）制作葡萄糖标准曲线参照DNS试剂测定还原糖实验中的方法制作。（二）酶液制备称取10.0g果蔬样品，置于经预冷的研钵中，加入20mL经预冷的95%乙醇，在冰浴条件下研磨匀浆后，全部转入到离心管中，低温放置10min，然后于4℃、12000×g离心20min。倾去上清液，向沉淀物中再加入10mL经预冷的80%乙醇，振荡，低温放置10min，然后在相同条件下离心。再取倾去上清液，向沉淀物中再加入5mL经预冷的提取缓冲液，于4℃放置提取20min，再经过离心后收集上清液即为酶提取液，4℃保存备用。（三）活性测定取两支刻度试管编号，分别加入1.5mL1%CMC溶液。向一支试管中再加入0.5mL酶提取液，向另一支试管中加入0.5mL经煮沸5min酶提取液作为对照，置于37℃恒温水浴保温1小时。取出后迅速加入1.5mL3,5-二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5min。然后迅速冷却至室温，以蒸馏水稀释至25mL刻度处，混匀。在540nm波长处按照与制作标准曲线相同的方法操作，分别测定各管中溶液的吸光度值。重复三次。五、实验结果与计算1．将测定的数据填入下列表重复次数样品重量W(g)提取液体积V(mL)吸取样品液体积Vs(mL)540nm吸光度值由标曲查得糖量C(mg)样品中纤维素酶活性(µg·h-1·g-1FW)样品对照样品-对照计算值平均值±标准偏差1232．计算结果根据样品反应管和对照管溶液吸光度值的差值，在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数。纤维素酶活性以每小时每克鲜重（FW）果蔬组织样品在37°C催化羧甲基纤维素水解形成还原糖的微克数表示，即µg·h-1·g-1FW。计算公式：式中：C——从标准曲线查得的葡萄糖量，mg；V——样品提取液总体积，mL；Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；t——酶促反应时