染色体原位杂交技术在植物体系育种中的应用

染色体原位杂交技术在植物体系育种中的应用

1植物染色体原位杂交原始杂交技术（ih）是成功结合药理学和组织化学的产物。1969年Gall、Pardue和John等首次建立该技术,并应用于组织切片和细胞标本上。此后,原位杂交技术广泛应用于动植物物理作图、杂种中供体基因组的识别、染色体易位互换的鉴别、内外源基因在转录、翻译水平上的特异性研究、基因组空间分布研究以及系统进化和亲缘关系研究等。原位杂交技术可以分为染色体原位杂交和RNA原位杂交。染色体原位杂交技术(chromosomeinsituhybridization,CISH)是根据核酸分子碱基互补配对原则,首先获得染色体DNA制片,然后将染色体制片DNA和经过放射性或非放射性标记的外源核酸即探针变性为单链,二者复性,成为杂合双链核酸,再通过一定检测手段将外源核酸在染色体上的位置快速、直观、准确地显示出来。RNA原位杂交则是用标记的外源核酸对组织细胞中的RNA进行原位定位。20世纪80年代末,出现了利用荧光素进行标记或检测的荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)技术,使信号检出率成倍提高。随着组织化学和分子生物学的进一步发展,CISH技术不断改进和完善,在方法上放射性同位素标记已逐渐被分辨率高、安全、节时的非放射性标记,如生物素、荧光素、地高辛等所取代,形成了从化学显色检测向荧光再向多色荧光检测、从常规杂交向原位PCR以及DNAFiber-FISH的发展格局,灵敏度和分辨率也逐步大幅度提高。CISH技术所用探针来源较广,任何分离、克隆或合成的核酸都可作为探针。目前在植物CISH中一般都使用高度重复的串联或散布的DNA序列。这些序列有些是物种专化的,有些可以在不同物种间产生可区分的特异杂交位点带型,以便将不同物种通过CISH区分开来或用于检测外源染色质的存在。CISH分析所用另一种探针是被打断的外源供体总基因组DNA,同时用受体总基因组DNA作封阻,这种方法被称为基因组原位杂交(genomicinsituhybridization,GISH)。GISH技术更直接简便,可与整条染色体杂交,而且杂交位点可以在细胞分裂任何时期观察到。CISH分析所用探针还包括较长的基因组克隆,如BAC、YAC乃至TAC克隆、单拷贝DNA序列、以及现有的RFLP标记等。CISH技术的程序较为复杂,主要流程为染色体标本制备,探针的制备、标记与检测纯化,探针与染色体的变性、原位杂交,杂交后的梯度洗脱,及原位杂交信号的放大与观察等步骤。其中第一步获取良好的染色体制片是技术关键之一,也是技术难点之一。在植物染色体原位杂交研究中,传统方法是采取植物幼嫩根尖作为制取有丝分裂中期染色体制片的材料。但有些植物尤其是木本植物很难取得大量分裂旺盛的根尖,这样不可避免地局限了原位杂交技术在更多植物种类上的应用。为了拓宽材料来源,只要是植物分生组织,就可以成为获取分裂相的研究材料如,幼嫩茎尖、愈伤组织、幼小花蕾等。染色体制片方法也直接关系到染色体的质量好坏。一般采取低渗酶解去壁法,可以得到铺散良好的裸露染色体,且制片背景干净,有利于探针与靶染色体的有效杂交。GISH技术中,另一关键是采取适当的探针DNA与封阻DNA的混合浓度比例,这个比例通常依据研究材料的亲缘关系的不同而不同。在植物遗传育种研究中,染色体原位杂交技术在检测外源染色质、染色体物理作图、物种起源进化及物种亲缘关系研究、双亲核基因组互作研究等方面应用较广。下面仅就染色体原位杂交技术在植物体细胞杂种及其有性后代遗传鉴定中的应用作一评述。2染色体杂植株细胞融合技术可有效地实现核基因组的转移与重组,是植物品种遗传改良的重要途径,目前很多植物都获得了体细胞杂种植株。应用CISH技术对植物体细胞杂种及其有性后代中双亲染色体的贡献、双亲核基因组行为及互作情况等进行分析,对进一步丰富植物细胞遗传学知识、认识植物体细胞杂交过程中的遗传重组规律和指导细胞工程应用于育种实践等都具有重要意义。2.1不同种类四倍体细胞的民法典分析植物不同品种细胞间融合,获得的体细胞杂种倍性一般为双亲之和,但也出现一些多倍体、非整倍体、单亲倍性等。番茄(Lycopersiconesculentum)与马铃薯(Solanumlycopersicoides)二倍体细胞间融合,再生了四倍体和六倍体,对其中4个四倍体和4个六倍体进行GISH分析表明,4个四倍体的染色体均等地来自双亲,而4个六倍体杂种的染色体中,来自番茄的有2套,另一套来自马铃薯,表明了GISH技术在鉴定倍性变异来源方面的有效性。Jelodar等以GISH技术证实了获得的水稻体细胞杂种(OryzasativaL.(+)Porteresiacoarctata(Roxb)Tateoka)8个株系中,1个为六倍体的株系植株包含双方亲本的所有染色体。2.2品种间异质体转导体的染色体分离和重组植物非对称体细胞杂交在转移供体部分性状、同时保持受体优良性状方面具有较大潜力,是近些年细胞融合研究的热点。植物对称细胞融合也可以产生非对称体细胞杂种。染色体原位杂交技术在研究非对称体细胞杂种中双亲染色体贡献方面具有其直观、准确的独特优点,其它技术无法替代。Piastuch等以克隆的品种特异重复序列作探针,对烟草(Nicotiana)非对称杂种进行了CISH分析,表明得到了只有供体1条染色体的高度非对称体细胞杂种,也获得了含供体8～12条染色体和染色体片段的杂种,而且8个杂种中,其中有3个存在染色体易位现象。Itoh等以品种特异重复序列作探针,应用CISH技术对经X射线处理的油菜(Brassicanapus)非对称杂种进行了研究,表明所检测的5个杂种都丢失了供体1～3条染色体,并且检测到了由于射线处理而导致的染色体重组(异常染色体)。Fahleson分离了芝麻菜(Erucasativa)的2个特异DNA重复序列作探针,FISH分析芝麻菜与油菜的体细胞杂种,显示出杂种中存在芝麻菜的基因组,进一步用芝麻菜的总DNA作探针,GISH揭示体细胞杂种中含1～2条芝麻菜的完整染色体,没有检测到两基因组间易位互换的现象。Ramulu等将含有转基因马铃薯植株一条或几条染色体的微原生质体与番茄原生质体融合,以期转移马铃薯的带有抗性基因的单个特异染色体。对再生植株进行GISH分析表明,几个微融合再生植株都含有供体1条染色体,且带有NPT-II和GUS基因,以及受体所有染色体。Rokka等用Solanumbrevidens的2个特异DNA重复序列作探针,对Solanumbrevidens与马铃薯的六倍体体细胞杂种进行FISH分析,发现该杂种大部分基因组成分来自于Solanubrevidens,对该杂种花药培养得到的三倍体植株的FISH实验揭示了同样主要由Solanumbrevidens的基因组组成。Buiteveld等对韭菜(Alliumampelopra.sumL.)(2n=4x=32)与洋葱(AlliumcepaL.)(2n=2x=16)的融合再生植株进行GISH分析表明,检测的6个杂种都缺少韭菜的2～7条染色体,其中一个杂种还丢失了洋葱的染色体,即含有韭菜的30条染色体,洋葱的12条染色体,以及3个重组染色体。Shishido等对水稻体细胞杂种(AA+BBCC)用McGISH(multi-colorgenomlcinsituhybridization)技术进行研究,包含的A、B、C3套基因组分别显示3种不同的荧光信号,结果发现所有杂种都含有A基因组的24条染色体,但B基因组的染色体较少,C组的常常缺失。Horsman等对马铃薯与龙葵(Solanumnigrum)融合再生的其中11颗植株进行GISH分析表明,9株具有预期的染色体来源组成,另有1株缺少了龙葵的14条染色体,即只有22条,而不是预期的36条,并丢失了马铃薯的1条染色体。2.3小麦染色体的数目及及化学计量特征检测植物体细胞杂种双亲核基因组重组、易位,即染色体结构重排现象较多。传统的方法很难辨别这些现象,GISH技术可以快速可靠地进行鉴定。韭菜与洋葱的体细胞杂种中,有1个杂种植株含3条重组染色体。Skarzhinskaya等在油菜与Lesquerellafendleri对称融合得到的体细胞杂种中,包含Lesquerellafendleri的染色体数目从2条到2套染色体组都有,非对称融合得到的体细胞杂种植株染色体数目在36条到78条之间,其中含38条的植株用GISH检测表明没有来自Lesquerellafendleri的染色体,这些杂种植株的染色体普遍存在基因组间或基因组内的重组现象。Garriga—Caldere等对马铃薯+番茄的1个体细胞杂种用GISH分析,表明其倍性接近6倍体,由46条马铃薯染色体、20条番茄染色体和2条易位染色体组成,同时证实了2个马铃薯一番茄单体附加系。Xia等采用普通二倍体小麦与紫外线照射的簇毛麦(Haynaldiavillosa)非对称融合,然后用GISH检查亲本小麦染色体进入融合细胞中的情况,发现数目并不稳定,且有微染色体或染色体片段。周爱芬等在得到对称及不对称融合小麦杂种后,GISH结果证实杂种中异源染色体间不同的易位及重组均普遍存在,不对称体细胞杂交直接导致的染色体小片段易位更多,显示出体细胞杂交在小麦育种上的独特优势。同时,周爱芬等在小麦与簇毛麦的体细胞杂种中用GISH确认了来源于双方亲本的染色体,并检测到双方亲本染色体之间有较多的易位现象。2.4染色体同源配对多态性在检查减数分裂时期染色体行为方面,GISH更具有其它任何技术不可替代的优势。以前仅仅只能通过形态观察同源染色体配对,现在通过GISH不仅能了解配对同源染色体的来源,还能观察到异源染色体易位互换重组现象。Wolters等应用GISH技术研究了番茄与马铃薯属间体细胞杂种的有丝分裂、减数分裂行为,发现存在很多异常现象。Parokonny等应用GISH技术对烟草非对称杂种及其有性后代减数分裂中的基因组行为、染色体易位等进行研究。结果表明,染色体同源配对多;在减数分裂各个时期都可以检测到包含双亲染色体片段的染色体易位现象;正常和重组染色体都能进入二分体和四分体。对非对称体细胞杂种自交和回交后代的GISH分析表明,重组染色体可通过雌雄配子传递;正在进行减数分裂或减数分裂以后,也可发生染色体重组,即出现新的重组。总之,研究表明,通过基因组间易位,非对称杂种中一个亲本的染色体片段可以稳定地整合进另一亲本,并传递给有性后代。Parokonny等对2个番茄六倍体体细胞杂种(Lycopersiconesculentum(+)L.peruvianum)进行GISH分析表明,无染色体重组等异常现象,为正常六倍体;其减数分裂的GISH分析表明,染色体多为同源配对,同源重组,且重组染色体继续同源配对。Gavrilenko等对栽培番茄与野生马铃薯体细胞杂种(Lycopericone.sculentum+Solamumetuberosum)的减数分裂进行GISH分析,发现番茄染色体有优先丢失的趋势;对该体细胞杂种花药培养再生的4棵植株进行GISH分析表明,双亲染色体在不同花药再生植株中的贡献均不同,即1株为二倍体,双亲染色体各贡献12条,2株非整倍体,分别多了番茄、马铃薯的1条染色体,另1株为超四倍体,双亲各贡献26条染色体。2.5马铃薯染色体的传递植物对称及非对称体细胞杂种中,由于双亲核基因组互作,杂种中双亲染色体在其有性过程中存在丢失、优先传递等现象。Jacobsen等对马铃薯(4x)+番茄(2x)的六倍体体细胞杂种与马铃薯(4x)的回交F1代和F2代进行GISH分析表明,F1代不是预期的五倍体(2n=5x=60),而少了番茄的3条染色体;F1代中来自番茄的9条染色体,在F2代中只转移了1～6条不等。杨丽梅等对马铃薯+番茄六倍体体细胞杂种与马铃薯回交F2代3份材料进行GISH分析,表明1份有2条染色体来自番茄,另一份有4条染色体来自番茄,其余1份来自番茄的染色体数目在不同细胞间不稳定(4～6条)。马铃薯(4x)+番茄(2x)六倍体体细胞杂种与马铃薯(4x)回交后的F1代植株,多数为单体,即含有番茄的1条染色体;有些为双体,即含有番茄的2条染色体。Garriga-Caldere等应用GISH和FISH技术对这些双体进行研究表明,番茄染色体在有性后代中之所以传递率相对较高,这是因为形成了正常的二价体,2条外源染色体在双体中分布更规则。Dong等对栽培马铃薯与野生马铃薯种间体细胞杂种、回交1代、回交2代进行GISH分析表明,4个体细胞杂种植株都不具有预期的染色体组成,双亲之一丢失了1条染色体;回交1代5棵植株,其中3棵具有野生马铃薯的1套染色体组,另2棵多或者少1条野生马铃薯的染色体,表明了野生马铃薯染色体在体细胞杂种中优先配对和分离;回交2代3棵植株,其中2株具有52条染色体,而不是预期的48条;研究表明该种间体细胞杂种回交1代中双亲染色体配对较差。HaiderAli等结合GISH和RFLP技术,对番茄与马铃薯体细胞杂种与马铃薯多次回交后的来自4个回交3代群体的105棵植株进行分析,在其中7棵回交3代植株中找到了5个单体异附加系,加上以前的结果,番茄12条染色体的单体异附加系都建立起来了。HaiderAli等还利用GISH技术证实了马铃薯与番茄融合的四倍体体细胞杂种与二倍体野生番茄有性杂交得到的三倍体杂种含3套不同的染色体组:马铃薯、野生番茄、栽培番茄,同时弄清了减数分裂时期二价体由野生番茄与栽培番茄配对形成,单体来自马铃薯的染色体,三价体则由这3套基因组中的同源染色体配对而来。3细胞杂交及基因原位杂交分析体细胞杂交技术在柑桔品种改良方面较有潜力,目前国际上已获得近200例柑桔体细胞杂种,其中60余例为柑桔属(Cit