基于荧光原位杂交技术的uasb颗粒污泥产甲烷菌群分析

基于荧光原位杂交技术的uasb颗粒污泥产甲烷菌群分析

产甲醇菌群是重要的厌氧菌群，对清除污染物的生物活性作出了重要贡献。这一直是现代厌氧生物技术的热点。其中，荧光原聚积分离技术（fish）在厌氧污泥分析中得到了广泛应用，并不断改进和改进。在文献[7.9]中，用fish技术确定了啤酒废水处理工业化或实验室规模装置中的厌氧菌，并发现了优势产甲醇菌群及其在污泥中的分布。描述了产甲醇菌群与污泥中的宏观性质，如沉降关系。采用fish技术测定了不同产量的异质结，这会影响到废水的产甲醇菌群。这些研究可以深入了解厌氧污泥的产甲醇菌群特征以及与污泥生物活性的关系。厌氧生物处理主要应用于高浓度有机废水理,已有厌氧颗粒污泥产甲烷菌的研究多侧重于降解食品工业废水或人工模拟废水.事实上,废水水质对厌氧颗粒污泥中产甲烷菌群具有重要影响,特别是废水中存在有毒有害或难降解污染物时,将对产甲烷菌群及产甲烷活性造成影响.Chen等研究表明废水中酚、对苯二酸、苯甲酸等污染物会造成污泥中产甲烷菌群的差异;Liu等在PCP废水处理的过程中观察到PCP对厌氧颗粒污泥产甲烷活性的抑制影响.抗生素生产发酵废水是典型的高浓度有机废水,多采用厌氧生物处理.抗生素废水的重要水质特征是具有抗生素残留,对处理系统中微生物种群具有一定影响.分析抗生素废水处理厌氧颗粒污泥,特别是实际运行的工业化厌氧反应器颗粒污泥产甲烷菌群及其与污泥生物活性的关系,有助于深入认识抗生素废水对厌氧处理系统的影响.本研究以阿维菌素废水处理工业化UASB颗粒污泥为对象,采用FISH技术对不同产甲烷菌群在厌氧颗粒污泥中的分布形态和相对丰度进行了分析,并探讨了产甲烷菌群与污泥产甲烷活性和污染物去除活性的关系.1材料和方法1.1污泥粒径分布本研究中厌氧颗粒污泥样品取自河北石家庄某阿维菌素废水处理工业化UASB反应器(500m3),污泥平均VSS/SS值为0.941.将UASB颗粒污泥样品用标准筛筛出<0.6mm、0.6~1.0mm、1.0~2.0mm、>2.0mm这4种粒径的污泥样品,其质量分数为14.8%、5.3%、60.3%和19.6%,VSS/SS值分别为0.905、0.940、0.957和0.945.1.0~2.0mm粒径污泥样品所占质量分数最大,为成熟颗粒污泥主体;0.6~1.0mm粒径污泥为未成熟颗粒污泥;>2.0mm粒径污泥为老化颗粒污泥;<0.6mm粒径污泥为解体颗粒污泥及未形成颗粒污泥的絮状污泥.1.2fish杂交1.2.1探针和探针的制备本研究采用4种寡核苷酸荧光探针:通用探针UNIV1392、一般产甲烷菌探针MPB1、产甲烷杆菌探针MEB859和产甲烷八叠球菌探针MSSH859,分别杂交不同目标的产甲烷菌群,如表1所示.探针由大连宝生物(Takara)公司合成.1.2.2探针的制备取250μL的污泥样品置于1.5mL离心管中,加入3倍体积的4%多聚甲醛固定.4℃静置1h,10000r/min离心5min,弃去上清液,再用1×PBS缓冲液清洗样品3次,然后将污泥样品涂在载玻片上,分别用50%、80%和100%的梯度乙醇进行脱水,每个系列3min.将1μL浓度为0.1nmol/μL的探针与9μL杂交缓冲液(0.9mol/LNaCl,0.01%SDS,0.02mol/LTris-HCl,一定浓度的甲酰胺,pH7.2)充分混合,然后将探针与杂交缓冲液均匀展开在污泥样品上,再把载玻片放入预先平衡好温度和湿度的分子杂交箱(UVP,HB-1000,美国)中,46℃杂交5h.杂交好的污泥样品用46℃的杂交清洗液(0.01%SDS,0.02mol/LTris-HCl,一定浓度的NaCl,pH7.2)清洗未杂交的探针和杂交缓冲液,再用46℃的灭菌ddH2O漂洗3次,后自然风干.双杂交:风干后,再按上述步骤在污泥样品上杂交另一种探针.1.2.3荧光杂交分析杂交后的污泥样品置于荧光显微镜(Motic,BA200,中国)下观察,每个样品取30个视野获得FISH杂交图像(Moticam2206).使用MoticFluo1.0荧光分析软件对图像进行分析,确定目标菌群的分布形态,并计算荧光杂交区域面积,根据公式(1)计算目标菌群的相对丰度.1.3最大比产甲烷活性测定最大比产甲烷活性:接种相同质量(VSS)的4种粒径的污泥样品,35℃恒温水浴培养,采用排水集气法测定污泥样品的产甲烷活性.间歇进水,水质组成为:1%酵母浸粉、1%胰蛋白胨、0.25%乙酸钠、0.25%甲醇、0.05%NH4Cl、0.02%K2PO4和0.005%MgCl2(以上浓度均为质量分数),pH值为7.2,COD为4000~5500mg/L,进水负荷为1.6~2.2kg/(m3·d).测定产气量随时间的变化,并用线性回归求得最大产甲烷速率K,最后根据公式(2)计算污泥样品的最大比产甲烷活性A.式中,A为污泥样品最大比产甲烷活性,g/(g·d);K为最大产甲烷速率,L/h;f为转换系数,g/L,取2.574;V为培养瓶中反应区的容积,L;S为颗粒污泥浓度,g/L.COD去除率:测定进水8h后COD的去除率,以此表征污泥样品去除有机污染物的宏观生物活性.2结果与讨论2.1甲烷菌群向颗粒污泥中分布和相对丰富2.1.1产甲烷菌种群形态本研究中所使用的3种产甲烷菌特异性探针分别针对一般产甲烷菌(Methanogens)、产甲烷杆菌(Methanobacteriales)和产甲烷八叠球菌(Methanosarcinales)进行检测,后两者是厌氧颗粒污泥中常见的优势产甲烷菌群.以不同粒径的污泥样品表征颗粒污泥形成的不同阶段,使用不同的特异性探针对不同粒径污泥样品表面的产甲烷菌群进行杂交,污泥样品表面的产甲烷菌群呈现出相同的分布形态.图1所示为粒径为1.0~2.0mm污泥样品表面产甲烷菌、产甲烷杆菌和产甲烷八叠球菌的分布形态.分布形态相同;产甲烷菌杂交区域面积较大,产甲烷杆菌和产甲烷八叠球菌交叉重叠分布[图1(d)].图2所示为产甲烷菌在4个粒径污泥样品表面的分布形态.分布形态相同.但是,不同产甲烷菌群在不同污泥样品表面杂交区域面积存在差异,表明产甲烷菌群相对丰度存在差异.以通用探针杂交区域面积为比较基准,计算不同产甲烷菌群在不同粒径污泥样品表面的相对丰度,平均相对丰度如图3所示.可以看到,随着污泥粒径增加,不同产甲烷菌群相对丰度均逐渐升高,1.0~2.0mm粒径污泥样品产甲烷菌群相对丰度最大,>2.0mm粒径污泥样品产甲烷菌群相对丰度又略有降低.以产甲烷菌为例,<0.6mm、0.6~1.0mm、1.0~2.0mm和>2.0mm4种粒径污泥样品表面的相对丰度分别为(25.50±8.63)%、(39.48±9.05)%、(47.08±8.26)%和(43.69±9.26)%.这个结果表明,随着颗粒污泥的逐渐形成,产甲烷菌群的种群规模逐渐增大;1.0~2.0mm粒径为成熟颗粒污泥,产甲烷菌群种群规模最大;随着颗粒污泥老化,产甲烷菌群种群规模又有所降低.同一粒径污泥样品表面,产甲烷杆菌相对丰度均大于产甲烷八叠球菌,且两者的相对丰度之和大于产甲烷菌.以1.0~2.0mm粒径污泥样品为例,产甲烷杆菌和产甲烷八叠球菌的相对丰度分别为(43.68±7.98)%和(35.31±6.24)%,两者之和大于产甲烷菌相对丰度(47.08±8.26)%.这个结果也说明产甲烷杆菌和产甲烷八叠球菌是交叉重叠分布的.同时,1.0~2.0mm粒径污泥表面产甲烷杆菌与产甲烷八叠球菌相对丰度之比为1.23,低于其他粒径污泥,表明产甲烷八叠球菌的相对比例更高.2.1.2厌氧颗粒污泥产甲烷菌分析将1.0~2.0mm和>2.0mm粒径的污泥样品剖开,在其内部剖面使用不同的产甲烷菌群特异性探针进行FISH杂交,不同产甲烷菌群分布形态相同,亦与表面分布形态相同.图4所示为产甲烷八叠球菌在1.0~2.0mm粒径污泥样品内部剖面和表面的分布形态.以通用探针杂交区域面积为比较基准,计算不同产甲烷菌群在污泥样品内部剖面的相对丰度,平均相对丰度如图5所示.可以看到,内部剖面不同产甲烷菌群相对丰度之间的关系与表面相同.1.0~2.0mm粒径的污泥产甲烷菌群相对丰度高于>2.0mm粒径的污泥,如1.0~2.0mm和>2.0mm粒径污泥内部剖面产甲烷菌的相对丰度分别为(48.67±8.87)%、(45.01±8.97)%;产甲烷杆菌相对丰度大于产甲烷八叠球菌,两者之和大于产甲烷菌相对丰度,如1.0~2.0mm粒径污泥内部剖面产甲烷杆菌和产甲烷八叠球菌的相对丰度分别为(44.94±8.78)%、(37.87±6.58)%,相对丰度之比为1.18,低于>2.0mm粒径污泥.同时,颗粒污泥内部剖面产甲烷菌群相对丰度大于表面,如1.0~2.0mm粒径污泥内部剖面和表面产甲烷八叠球菌的相对丰度分别为(37.87±6.58)%、(35.31±6.24)%.Jupraputtasri等采用FISH法检测淀粉废水处理厌氧颗粒污泥,其产甲烷菌的相对丰度为(50.7±6.9)%;Liu等利用条形斑点杂交(Slotblothybridization)检测啤酒废水处理厌氧颗粒污泥总rRNA,其中产甲烷菌rRNA的相对比例为62.4%.以上结果均高于本研究中阿维菌素废水处理厌氧颗粒污泥产甲烷菌群相对丰度.其原因可能在于处理水质的差异,特别是废水中阿维菌素残留的平均浓度为40mg/L,对颗粒污泥中产甲烷菌群具有一定的抑制作用.颗粒污泥内部剖面产甲烷菌群相对丰度高于表面也可能是因为内部产甲烷菌群受废水中阿维菌素的抑制影响较小.2.2污泥样品的生物活性厌氧颗粒污泥样品的宏观生物活性受到污泥中微生物种群结构的影响,不同粒径污泥样品产甲烷菌群相对丰度存在差异,可能会造成污泥产甲烷活性和污染物去除活性的差异.对4种粒径污泥样品的最大比产甲烷活性和COD去除率进行测定,以比较污泥样品宏观生物活性的差异,结果如表2所示.可以看到,不同粒径污泥样品最大比产甲烷活性和COD去除率变化趋势相同,均为随着污泥粒径增加而增大,至1.0~2.0mm粒径污泥样品时最大,最大比产甲烷活性为1.562g/(g·d),COD去除率为88.64%,>2.0mm粒径污泥样品又略有降低.这个结果说明污泥样品的产甲烷活性和有机污染物去除生物活性密切相关.同时,污泥样品宏观生物活性的变化趋势与产甲烷菌群相对丰度的变化趋势一致,证实污泥微生物种群结构对其宏观生物活性具有重要影响.值得注意的是,1.0~2.0mm粒径污泥样品表面和内部剖面产甲烷杆菌与产甲烷八叠球菌相对丰度之比分别为1.23和1.18,均低于其他粒径污泥样品,即产甲烷八叠球菌的相对比例更高.这个结果表明尽管产甲烷杆菌的相对丰度更大,但产甲烷八叠球菌对宏观生物活性的贡献可能更大.3产甲烷菌群相对丰度(1)产甲烷菌群在不同形成阶段(不同粒径)阿维菌素废水处理厌氧颗粒污泥表面和内部剖面的分布形态相同,产甲烷杆菌和产甲烷八叠球菌交叉重叠分布.(2)产甲烷菌群在不同形成阶段(不同粒径)颗粒污泥中的相对丰度存在差异:颗粒污泥表面和内