血流感染的早期诊断与病原菌识别课件

血流感染的早期诊断与病原菌识别1血流感染的早期诊断与病原菌识别101020304

血流感染的定义、诊断及流行病学

早期诊断与病原菌识别的方法-血培养相关问题早期诊断与病原菌识别-感染标志物相关问题

早期诊断与病原菌识别-分子生物学检测相关问题目录

201020304血流感染的定义、诊断及流行病学早期诊断与血流感染定义（BSI）败血症（septicemia）：病原菌及其毒素侵入血流所引起的临床综合征，是一种严重的全身感染性疾病，病原菌主要是细菌，也可为真菌、分枝杆菌等。菌血症（bacteremia）：细菌在血流中短暂出现的现象，一般无明显毒血症状，在国外文献中常与败血症通用。血流感染（bloodstreaminfection,BSI）：败血症和菌血症目前统称为血流感染。3血流感染定义（BSI）败血症（septicemia）：病原菌血流感染的诊断标准（2001年卫生部颁布）4血流感染的诊断标准（2001年卫生部颁布）4血流感染诊断标准（1996美国疾病控制与预防中心）

血培养1次或1次以上阳性,阳性病原体与其他感染部位无关。患者至少有以下1项症状或体征:发热(38℃)、寒战或低血压,

同时至少满足以下任意1项:①若血培养为常见的皮肤寄植菌需有不同时间2次或2次以上的血培养阳性。②若血培养为上述常见皮肤寄植菌,血培养仅1次阳性则需同时有静脉导管培养为阳性的同一病原菌且已开始正确的抗微生物治疗。③血抗原测定阳性,且症状、体征、实验室结果不能用其他部位的感染来解释5血流感染诊断标准（1996美国疾病控制与预防中心）血培养血流感染流行病学资料全球：1800万病例美国：确诊病例130万欧洲和日本：确诊病例190万每年治疗费用：167亿美金－美国67亿美金－欧洲导致死亡病种排名第十位每年导致大约40万人死亡败血症在10年间增加了139％非心内ICU病区最常见的死亡病因在130万病例中，有78万例发生在ICU病区CritCareMed2001;29:1303-106血流感染流行病学资料导致死亡病种排名第十位CritCa国内血流感染的病死率结论：普通住院患者BSI的病死率为20.7%，烧伤、血液病肿瘤以及ICU患者病死率更高，而新生儿病房、肝病及糖尿病患者则相对较低。医院BSI病死率为26.8%，明显高于社区BSI的病死率。近几十年来，BSI住院病死率呈下降趋势。7国内血流感染的病死率结论：普通住院患者BSI的病死率为20.病死率临床表现血培养治疗问题

血流感染病情凶险，死亡率高达26-41%

阳性率低，培养结果所需时间长（2-5天）

临床表现缺乏特异性，诊断困难

不恰当的经验性治疗易导致细菌耐药及医疗资源浪费

血流感染早期诊断治疗存在的问题8病死率临床表现血培养治疗问题血流感染病情凶险，死亡率

早期诊断与病原菌识别的主要方法

快速检测方法，包括原位分子杂交、聚合酶链反应、基因芯片、质谱技术等

针对免疫和炎症反应的指标;包括TNF-a、PCT、IL-6、CRP、乳酸及内毒素等，特异性差

血培养分子生物学检测感染标志物检测血流感染诊断的金标准，但阳性率低，检测周期长（3-7天）9

早期诊断与病原菌识别的主要方法

快速检测方法，包血流感染的血培养方法临床细菌/真菌检测常用的方法生化表型全自动微生物鉴定/药敏分析系统10血流感染的血培养方法临床细菌/真菌检测常用的方法生化表型全自血培养研究对2004年1月-2005年12月入住RobertWoodJohnson大学附属医院及Duke大学医疗中心且血培养阳性的成人患者进行回顾性分析，患者在24h内均接受≥3次血培养研究旨在评估血培养次数与阳性率的相关性LeeAetal.JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY.2007;45(11):3546–354811血培养研究对2004年1月-2005年12月入住Rober单一病原体感染：多次血培养可提高阳性率24小时血培养次数≥3次或4次的患者，前两次血培养的阳性率<90%；而前4次血培养的阳性率>99%阳性率LeeAetal.JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY.2007;45(11):3546–354812单一病原体感染：多次血培养可提高阳性率24小时血培养次数≥3混合感染：多次血培养可提高阳性率研究期间，共发生58例由多种病原体导致的血流感染，该类患者前三次血培养的阳性率为100%阳性率N=58例LeeAetal.JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY.2007;45(11):3546–354813混合感染：多次血培养可提高阳性率研究期间，共发生58例由多种病原体血培养的阳性率与采血体积相关导致血流感染的G-菌、G+菌、厌氧菌及真菌，其血培养的阳性率均与采血体积相关阳性率标准体积：采血量为7-10ml,平均8.7ml;低体积：采血量<3.5ml;平均2.7mlMermelLAetal.AnnInternMed.1993;119:270-272.14病原体血培养的阳性率与采血体积相关导致血流感染的G-菌、G+CLSI指南对血培养次数及采血体积的推荐CLSI指南推荐：菌血症的患者行4次血培养，且每次采血量为10ml，可获得90-95%的阳性检出率当血培养次数增加到6次时，阳性率可增加至95-99%TownsMLetal.JMicrobiolImmunolInfect2010;43(4):347–34915CLSI指南对血培养次数及采血体积的推荐CLSI指南推荐：T血培养的报阳时间价值结论：结合血培养阳性报警时间结合临床其他指标，对于早期判断检出菌为病原菌或污染菌具有一定的参考价值。16血培养的报阳时间价值结论：结合血培养阳性报警时间结合临床其他感染标志物的诊断价值降钙素原主要是在甲状腺旁细胞内分泌的无激素活性的降钙素前肽物质，发生全身感染及炎性反应时，细菌毒素和炎性细胞因子的诱导刺激下，ＰＣＴ分泌迅速升高，但在病毒感染时水平很低，血清ＰＣＴ水平高低反映疾病严重状态，是判断预后的良好指标。细胞因子参与机体的抗炎、抗感染及免疫调节作用，尤其在抗感染及严重感染方面起着重要作用，细胞黏附分子（ＣＡＭ）参与机体免疫反应、炎性反应等一系列生理病理过程.包括IL-6、IL-8、TNF-a、VCAM-1等

革兰阴性菌进入血液释放内毒素可引起内毒素血症，CRP是重要的急性时相反应蛋白之一，主要由IL-6分泌，血流感染时明显增高，敏感性高，

降钙素原PCT细胞因子及黏附因子

内毒素及CRP（1-3）β-Ｄ葡聚糖

普遍存在于各种真菌中，是真菌细胞壁的主要结构之一，真菌感染时明显增高，检测敏感、快速。

17感染标志物的诊断价值降钙素原主要是在甲状腺旁细胞内分泌的无激降钙素原诊断价值选择2011-2014年4家医院的4279例感染患者，进行降钙素原、SIRS评分及乳酸水平监测和血培养检查，并对535例血培养阳性的血流感染患者进行相关指标分析，评价降钙素原对血流感染的诊断价值18降钙素原诊断价值选择2011-2014年4家医院的4279例降钙素原诊断价值

血流感染标本细菌的分布情况

血流感染时多因素分析19降钙素原诊断价值血流感染标本细菌的分布情况

降钙素原诊断价值

结论：PCT为血流感染的独立影响因素，即使在血乳酸正常或SIRS评分阴性时，PCT增高应查找可能发生的血流感染20

降钙素原诊断价值

结论：PCT为血流感染的独立影响因不同感染标志物的诊断价值-1结论：PCT、CRP及IL-6联合检测较单项检测诊断价值更高，且能在1天内报告检测结果，有助于细菌性BSI的早期诊断和治疗，可为临床医师提供快速、可靠的实验室依据21不同感染标志物的诊断价值-1结论：PCT、CRP及IL-6

不同感染标志物的诊断价值-2

回顾性分析重症监护病房(ICU)确诊为脓毒症且血培养阳性的132例患者的临床资料，根据血培养结果将脓毒症患者分为革兰阴性(G-)杆菌血流感染组(98例)和革兰阳性(G+)球菌血流感染组(34例)，比较两组患者6h内的炎症因子，如白细胞计数(WBC)、中性粒细胞比例(N)、CRP、PCT、内毒素水平等的差异及其之间的相关性；绘制各炎症因子对血流感染所致脓毒症诊断的受试者工作特征曲线(ROC曲线)，根据曲线下面积(AUC)来评价其对血流感染所致脓毒症的诊断价值，根据最佳诊断临界值评估各数值对血流感染诊断的敏感性和特异性22

不同感染标志物的诊断价值-2

回顾性分析重症监护病

不同感染标志物的诊断价值-2

结果显示G-菌BSI患者的血浆PCT、内毒素及血清CRP水平均明显高于G+菌BSI患者；ROC曲线分析显示，血浆PCT诊断G-菌BSI患者的AUC为0.825，当PCT>2.455微克/L,诊断G-菌BSI的敏感度为71.4%，特异度96.2%。在G+菌血流感染所致脓毒症患者，PCT的AUC为0.619，最佳诊断临界值>1.585微克/L,敏感度41.2％、特异度82．诊断细菌性BSI时，血浆PCT的敏感性和特异性较血清CRP、血浆内毒素明显增高结论：G-菌血流感染所致脓毒症患者PCT、CRP、内毒素水平高于G+菌血流感染者，三者联合检测有望成为早期判断血流感染所致脓毒症及其病情严重程度的指标。23

不同感染标志物的诊断价值-2

结果显示结论：G-菌血流感染分子生物学指标监测聚合酶链反应（PCR）荧光原位杂交技术基因芯片技术质谱技术24分子生物学指标监测聚合酶链反应（PCR）荧光原位杂交技术基因一、荧光原位杂交技术（FISH）核酸杂交技术

核酸杂交是指具有一定互补序列的2条核酸单链在液相或固相体系中按碱基互补配对原则形成同源或异源双链分子的过程。核酸杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的2条条单链之间进行。其中，荧光原位杂交技术（FISH）应用于临床实验室鉴定工作已有10余年，其检测的敏感性和特异性可达到96-100%25一、荧光原位杂交技术（FISH）核酸杂交技术

核酸杂交是指具血培养阳性－PNAFISH

核酸荧光原位杂交血培养阳性肉汤革兰染色PNAFISH革兰阴性菌：商品化试剂盒eco/kpn/paeEfa/其它肠球Sau/scnCal/cgl/其它念珠菌报道Salmonellaspp.90minPNAFISH完成ApplEnvironMicrobiol.2010;76:4476

J.Clin.Microbiol.2013,51(4):1301JClinMicrobiol.2009;47:24726血培养阳性－PNAFISH

核酸荧光原位杂交血培养阳性肉汤荧光原位杂交技术-细菌早期识别新的荧光原位杂交技术对血培养阳性快速病原体识别结果显示：152例患者血培养阳性的个标本中，FISH鉴定细菌生长的阳性例标本数145个。在病原菌鉴别中138例准确，7例错误，微生物识别准确率95.2%,可信区间95%。在需氧菌和厌氧菌的鉴别没有差异。对血培养阳性病原菌鉴别时间为30分钟，上机时间仅需10分钟。结论：荧光原位杂交技术对于血流感染的快速诊断和病原菌精确识别具有重要的临床意义27荧光原位杂交技术-细菌早期识别新的荧光原位杂交技术对血培养阳荧光原位杂交技术-真菌早期识别对照性研究通过对疑似侵袭性真菌感染患者血培养和脑脊液中病原体的检测，以评价FISH技术的诊断价值。28荧光原位杂交技术-真菌早期识别对照性研究28

荧光原位杂交技术-真菌早期识别

在112份脑脊液标本中，FISH检测真菌的阳性率稍高于传统墨汁染色显微镜检测值（48/46），且阳性结果敏感性和特异性均为100%。对血标本中病原菌的鉴别能力传统方法、PCR-RFLP及FISH没有差异（14/30）血培养确定微生物生长后进行病原菌识别的平均时间有明显差异，传统显微镜识别、PCR-RFLP及FISH分别为6天、12小时和5小时结论：荧光原位杂交技术在侵袭性真菌感染的病原菌识别方面具有重要价值29

荧光原位杂交技术-真菌早期识别

在112份脑脊液标本中，F二、基因芯片技术基因芯片(genechip)

基因芯片也称DNA微阵列，可分固相基因芯片和液相基因芯片。基因芯片检测基本原理是将已知的核酸片段固定在一定的固相支持物表面制成核酸探针，利用碱基互补原理，使其与待测DNA标本进行杂交反应，从而获得需要的生物学信息。液相基因芯片是近年来发展出的一种新的芯片技术，与固相芯片相比，液相芯片在反应动力学、反应速度、检测敏感性、稳定性以及自动化程度方面都有较大的优越性商品化基因芯片血流感染病原体检测均应用于阳性血培养物（血培养阳性病原菌鉴定）30二、基因芯片技术基因芯片(genechip)

基因芯片也称结果：标本病原菌识别率为86%（1807/2017），敏感率为94.7%（95%CI），特异性为98.8%。而对MRSA的特异性为100%。病原菌检测时间仅需18小时结论：基因芯片技术对细菌种类进行最终鉴定具有较传统血培养敏感性高、特异性强及时间更短的特点。有利于临床脓毒症快速诊断和早期治疗。基因芯片技术对血培养阳性标本进行细菌种类准确、快速鉴定的一项观察性研究对英国和芬兰两个医学中心3318例疑似脓毒症患者的2107份血培养阳性标本用新型的PCR扩增和基因芯片技术检测鉴定血标本中病原菌，并与常规的细菌培养方法对照31结果：标本病原菌识别率为86%（1807/2017），敏感率三、质谱技术质谱(massspectrometry,MS)技术，尤其是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

(MALDI-TOFMS)，具有简便、快速及特异地分析微生物大分子标记物质谱图，从而实现临床微生物检验中细菌、真菌及病毒在属、种、株水平上的鉴定。MS在菌血症、尿路感染、毒素检测及耐药监测方面显示出巨大的优势，有望成为临床微生物实验室感染性疾病常用诊断方法

弗朗西斯·阿斯顿于1919年制成的第一台质谱分析仪，1922年诺贝尔化学奖32三、质谱技术质谱(massspectrometry,MS)MALDI-TOFMS操作步骤33MALDI-TOFMS操作步骤33MALDI-TOFMS快速鉴定阳性血培养使用菌落、阳性血培养肉汤鉴定快速：20分钟(从报警到鉴定出结果）MALDI-TOFMS(Bruker)+BACTEC(BD):正确鉴定：193/213阴性菌（包括厌氧菌）(90.61%)，284/319阳性菌(89.02%)80.9%复数菌正确鉴定出一种，7株缓症链球菌鉴定为spnMALDI-TOFMS(Bruker)+BacT/ALERT(bioMérieux):388个阳性瓶，种正确率91%（包括念珠、厌氧菌）15瓶复数菌：使用通用库多鉴定出一种，革兰染色后使用阴性或阳性库分析，6瓶鉴定出第二种菌ClinMicrobiolInfect2010;16:1631

JClinMicrobiol2010;48:154234MALDI-TOFMS快速鉴定阳性血培养使用菌落、阳性血培MALDI-TOFMSVITEKMS(bioMérieux)以16s为金标准，980株临床分离株，ID正确率肠杆菌科97.7%非发酵菌92%葡萄球菌属94.3%链球菌属84.8%HACEK84%酵母菌85.2%J

ClinMicrobiol.2010;48:90035MALDI-TOFMSVITEKMS(bioMérieu四、聚合酶链反应（PCR）核酸扩增及DNA序列分析

PCR是一种体外核酸扩增技术。目前,PCR已成为分子生物学及其相关领域的经典试验方法。PCR在血流感染微生物检测和鉴定中的应用体现在3个方面：一是对纯的病原菌鉴定；二是对血培养阳性培养物快速鉴定；三是对临床标本中难以培养病原菌进行检测和鉴定。可通过2种方式检测和鉴定病原微生物，一是使用特异引物扩增检测病原微生物目标基因；二是使用通用引物扩增检测细菌16SrRNA和真菌ITS及5.8S、26SrRNA等基因D1/D2序列，同时进行测序分析

KaryB.MullisTheNobelPrizeinChemistry199336四、聚合酶链反应（PCR）核酸扩增及DNA序列分析

PCR是阳性血培养－基于PCR的检测PCR特异性检测病原特异性PCR特定耐药基因检测：葡萄球菌mecA,肠球菌van细菌载量：肺炎链球菌自溶毒A基因lytA拷贝数广谱检测：PCR扩增特定靶位多态性分析测序后续基因检测种特异性real-timePCRExpertOpin.Med.Diagn.2012,6(3):209.CurrOpinInfectDis.

2011,24(2):13737阳性血培养－基于PCR的检测PCR特异性检测ExpertO保守区——反应亲缘性可变区——反应菌种间差异广谱性细菌/真菌感染核酸检测-临床应用检测方法：核酸检测16srDNA/18srDNA-“细菌/真菌身份证”(每个细菌/真菌都有的一个基因)38保守区——反应亲缘性广谱性细菌/真菌感染核酸检测-临床应用检不明微生物感染病原体广谱检测检测方法：PCR+ABI3730xl测序法类型报告周期样本采集细菌感染检测1天内标本要求：痰液、肺泡灌洗液等真菌感染检测结核杆菌检测

检测内容

39不明微生物感染病原体广谱检测检测方法：PCR+ABI3细菌16s/真菌18s检测16srDNA/18srDNA-“细菌/真菌身份证”临床细菌/真菌检测常用的方法细菌/真菌培养生化表型检测确定菌种基因检测病原体培养检测时间3-5天(最快18h)3-7天，阴性结果2个月灵敏度10-100copies＞10*5copies特异度可区分＞1000种菌＜350种菌局限性＜100个菌为阴性苛氧菌，厌氧菌不易培养；不能早期诊断技术条件要求PCR扩增无菌37℃培养箱与显微镜临床意义确定感染怀疑感染细菌16S分型——“细菌分型的金标准”40细菌16s/真菌18s检测16srDNA/18srD聚合酶链式反应检测诊断血流感染1CriticalCareMedicine2015目的：选择欧洲6个国家共9个ICU529名重症感染患者所采集的标本进行血培养和分子生物学检测，其中包括616份血流感染、185份肺炎及110份无菌区液体或组织的样本，评价聚合酶链反应检测方法的潜在临床意义分子检测技术用于血流感染、肺炎及无菌部位感染的危重病人快速