荧光原位杂交技术及其在遗传学中的应用

荧光原位杂交技术及其在遗传学中的应用

fluentifybridization是一种创新技术，将细胞遗传、生物学和免疫科技细节相结合。用荧光色素标记的核电站作为检测对象，按照碱基互用的原则，将检测材料中的核酸与特定性质结合起来，形成检测到的混合双链核，或将含有报告分子的偶尔原子作为检测触发点。混合后，用含锆开发分析报告分子的亲水或抗体，并对测量数据进行定性、定量或相对定位分析。本文就FISH技术在遗传学中的应用和近年来的进展做一简单的综述。1间期细胞核和损伤的诊断FISH技术用于遗传学各个领域有着无比的优越性:分析方法简便迅速、直观性强;既可以检测中期分裂相又可以检测间期细胞核;既可以识别常规染色体分析不能识别的标记染色体又可以分析一部分显带染色体技术不易分辨的异常,如某些倒位、易位、微小缺失、复杂畸变等;敏感性和特异性非常高。1.1交技术发展的动因由于DNA分子在染色体上呈线性排列,因此可以用基因或基因片断作为探针与染色体标本进行荧光原位杂交从而将基因定位在染色体上。基因定位是荧光原位杂交技术在分子细胞遗传学上的最初应用,也是荧光原位杂交技术发展的原动力。该方法克服了传统的放射性标记原位杂交定位基因技术的许多不足之处,能直接定位一个基因的物理位置,为进一步在分子水平上的分析提供一个参考点,FISH能定位小至1kb的DNA片段。有研究利用FISH已将13个不同的DNA片段定位到了11号染色体的长臂上。用不同颜色荧光素标记两个不同的DNA链,当它们在染色体上的距离大于1Mbp时,可以依据不同探针信号的排列关系分辨他们在染色体上的顺序。如果使用间期细胞,两个DNA链的距离可以缩短至50kbp,这个间距是染色体上的分辨距离的1/20。不同探针的次序可以通过测量其在间期细胞的距离来确定。以此绘制基因图谱。1.2fish的检测结果1993年FISH技术就被美国遗传学会(ACMG)允许用于产前辅助诊断,而到2000年鉴于FISH技术具有高度的敏感性和特异性,美国宣布FISH技术可以用于常见染色体数目异常的确诊,而不再仅仅作为辅助性产前诊断手段。在2001年TepperbergJ等对FISH技术进行快速产前诊断的结果与核型分析结果进行了大样本比较,共47312份有效标本中,FISH法仅有9例出现了假阳性结果,假阳性率为0.019%,有32例出现了假阴性结果,假阴性率为0.049%。此后,FISH技术在一些发达国家被广泛用于快速产前诊断。由于13,18及2l号染色体以及X和Y染色体数目异常占胎儿染色体异常的65%,占胎儿染色体数目异常的80%～95%,因此目前FISH方法检测试剂盒主要是针对这5条染色体,检测结果一般可以在24～48h就可以获得,且检测结果与核型分析结果的一致性可以达到99.5%以上。90年代以后,FISH技术广泛应用于遗传病的检测,杜梅君等利用生物素标记的X-着丝粒探针、特异区域单拷贝序列探针21q22.3、地高辛标记的重复序列探针pY3.4通过单色及双色荧光原位杂交分别对7例性腺发育不全、5例唐氏综合症患者外周血染色体及间期细胞进行荧光原位杂交(FISH),成功地诊断出21三体;45,XO;46,XX/45,XO;45,XO/47,XXX;46,Xi(Xq);47,XXY等染色体异常的病例。1.3重新确定第1种是多元参与博弈型乳腺癌背景2的基因组织以分子中心,主要分为3-t-3和3号小体3肿瘤的发生、发展、预后与染色体的数量、结构异常密切相关,肿瘤生物学水平高危因素有DNA错配修复基因的功能障碍导致的微卫星的不稳定性、18q的杂合性丢失、差异表达等。应用FISH能快速准确地显示染色体数目异常和结构异常,并利用混合多色探针可检测特定染色体易位。对肿瘤的诊断治疗及预后的判断又指导意义。2000年,就有文献报道使用商业化探针UroVysis(雅培公司)用于膀胱癌的诊断,灵敏度达到82.4%,特异度为91.8%。原发性乳腺癌的杂合性缺失发生在3p上的3个位点,用3号染色体着丝粒探针和几个特定位点Cosmid或YAC探针检测Kaposis肉瘤里3p14-ter区位点丢失。在原发性乳腺癌中有20%～30%的人类表皮生长因子受体2(HER2)基因的扩增和蛋白过度表达,HER2过度表达的乳腺癌浸润性强,预后差。另外,HER2的状态是乳腺癌药物(蒽环类药物和曲妥珠单抗)治疗的主要参考指标。其中曲妥珠单抗(赫赛汀)是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体,选择性地作用于HER2的细胞外部分,适用于治疗HER2过度表达的乳腺癌。由于只有HER2过度表达或HER2基因扩增的乳腺癌患者用赫赛汀治疗才有效,因此检测HER2的状态非常重要。目前主要采用FISH法检测HER2基因扩增的水平。由于一些回顾性研究发现用FISH法预测赫赛汀疗效好于免疫组化等其他方法,因此,FISH被认定为检测HER2状态的金标准。血液系统肿瘤患者大多数有染色体数目改变,有报道80%以上的AML有非整倍体,特别是亚二倍体。1991年Kreker等曾应用FISH对3种患者检查了常规方法不易发现的低百分率8号三体性细胞和12号染色体三体,含12号染色体三体的CLL患者预后佳。白血病、淋巴瘤都具有特异染色体的易位,而在慢性淋巴细胞性白血病患者中,如检测到RB1的缺失则提示患者预后较好,中位生存期可达到133个月。2fish技术的最新2.1荧光原位杂交探针的制备方法早期探针是一段带有荧光色素或(半)抗原的核酸序列。其长度介于15至数千个核苷酸,但以250～650个核苷酸的探针杂交效果最好。获取探针的方法有化学方法合成探针、克隆法获取探针、PCR扩增获取探针。探针的标记方法有缺口平移法、随机引物法、PCR法。寡核苷酸探针、肽核苷酸(PeptideNucleicAcid,PNA)探针是近期发现的2种新型探针。鉴于它们的特点和优点,有望取代以往的DNA或RNA作为荧光原位杂交探针。下面分别加以叙述。2.1.1ndna检测寡核苷酸探针是根据探针靶序列的碱基顺序,用化学方法合成的单链DNA(singlestrandDNA,ssDNA)。其长度为15～50个核苷酸,由于分子小,更容易渗透到细胞的目标区域,但也限制了其所能携带的荧光基团或报告分子的数目,并最终导致杂交后,荧光信号较弱。因此,这类探针仅适用于对重复单位较短的高度重复序列(如染色体端粒序列)的荧光原位杂交分析。2.1.2pna与dna的杂交PNA寡聚物是一类新型分子,其结构与DNA相似。但在PNA中,没有核糖-磷酸基骨架,其骨架是不带电的肽链(聚酰胺)。PNA与DNA杂交时,也遵循A-T,C-G碱基配对原则。与DNA相比,PNA对热稳定、与DNA的结合不依赖于离子强度,因此杂交时受探针变性温度和溶液pH值的影响较小。但由于PNA探针只能通过化学方法进行合成,而且合成费用较高,因此迄今所用的PNA探针还仅限于染色体的泛着丝粒(Pan-centromere)和泛端粒(Pan-telomere)探针。2.2荧光素标记探针M-FISH的最大特点是可将多次繁琐的FISH实验和多种不同基因的定位在1次FISH实验中完成。Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰荧光素(AFA)标记探针建立了双色FISH技术。1990年Nederlof等提出用3种荧光素探测3种以上的靶位DNA序列,创建了多色FISH方法。以下3种方法是在多彩色FISH基础上发展起来的新技术。2.2.1染色体与检测方法染色体描绘(chromosomepainting)是用全染色体或区域特异性探针,通过多彩色FISH使中期细胞特异染色体和间期核呈现不同荧光颜色的条带,从而分析染色体的方法,常用于识别染色体重组、断裂点分布、鉴别染色体外核物质的起源。反转染色体描绘(reversechromosomepaint-ing)是用筛选出的畸变染色体与正常染色体杂交来分析畸变染色体的方法,它不仅能区分标志染色体的来源,而且能分辨间隙易位和复杂的标志染色体。多彩色原位启动标记(multicolorprimedinsitulabeling,multicolorPRINS)是用寡核苷酸作为引物,原位PCR扩增待测序列,并在此过程中掺入荧光素直接或间接标记的核苷三磷酸,使扩增出的序列都得以标记。通过几轮这样的扩增,使待检的几个序列的原位扩增产物标记上不同荧光素,实现同时对多个微小缺失和突变等染色体微小改变的检测。这方法已常规用于检测特异性α卫星序列在染色体和间期核内的定位。2.2.2内镜染色体同源性比较内镜ch比较基因组杂交(comparativegenomichybridization,CGH)的基本原理是先分离出正常组织和肿瘤组织中的全部DNA,分别用不同荧光素标记,如正常DNA标以红色,肿瘤DNA标以绿色,把它们混合后,与待检染色体杂交,若结果呈黄色即为正常,若呈红色则说明有染色体缺失,若呈绿色则说明有对应序列的基因扩增。与FISH相比,CGH在一次实验中能对肿瘤样品中整个基因组中的DNA扩增和缺失等变异获得整体认识,并描绘出相应的CGH核型图,可在物种间进行染色体同源性比较,从而弥补了常规FISH只适于小部分肿瘤的不足。CGH最适合于检测实体瘤、淋巴瘤等不易得到高质量染色体标本的疾病。CGH另一无法替代的优点是它可在一次杂交中检测整个基因遗传物质的增加或减少,但精度有限,检测不出微小的扩增或缺失,仅适用微切割(microdissec-tion)和PCR技术与CGH的结合使其越来越广泛地应用于多种肿瘤研究。但CGH不能检测DNA的结构重排如反转和转座,并且其灵敏度和分辨率都有一定的限制。要对那些微弱变化进行定量分析,高分辨率的显微装置和专业化图像分析系统对M-FISH是至关重要的。2.2.3基于荧光定量成像的染色核型序列光谱染色体自动核型分析(spectralkaryotyping,SKY)是一项显微图像处理技术,首先由Dr.ThomasRied(NHGRI,NIH,Bethesda,MD)实验室于1996年发表在Science(273:494-497)。在染色体核型排序的应用上,SKY可同时分辨人类的22对染色体及XY性染色体或老鼠的21种不同染色体,并以各种颜色呈现出来。该方法结合了傅立叶频谱、电荷耦合设备成像和光学显微方法,同时计量样本在可见光和近红外范围内所有点的发射频谱,因而可以使用多个荧光染料的频谱重叠的探针。与一般荧光原位杂交不同的是其同时使用24种染色体的涂染探针,而杂交的靶DNA可以是疾病标本或细胞系的中期染色体,这一点与比较基因组杂交(CGH)使用正常外周血淋巴细胞中期染色体不同。2.3第一次检测质粒的可行性随着科学技术的不断发展,