抑郁症大鼠神经元结构及发病机制的研究

抑郁症大鼠神经元结构及发病机制的研究

fos蛋白抗体免疫组化法是一种新的方法，反映了神经功能的路径。它经常被用来科学研究，在高血压研究中没有使用。我们在绝望行为(BD)模型大鼠脑上应用该法观察了fos蛋白免疫阳性(FLI)神经元的分布情况,并以单纯强迫游泳(SFS)模型大鼠做为对照组,找出了该神经元的分布在两组内存在差异的部位,旨在探讨抑郁症的神经元结构及发病机制。材料和方法一、动物饲养实验动物模型:采用体重160~180g的Wistar系雄性大鼠30只(延边大学医学院实验动物科提供),先在安静、温暖(25℃)、避免强光的环境内饲养5天。将动物随机分为2组,经受BD第1,2次试验(以下分别简称第1次试验、第2次试验)的为实验组(n=20),只经受第2次试验的为对照组(n=10)。二、方法1.不动状态时间按Porsolt等的方法进行。在高42cm、底面直径20cm的圆柱形透明玻璃缸内倒入25℃的自来水使水位达到20cm,将动物放入水缸内使其游泳15min(第1次试验),并用以1/100s为单位的秒表(HITACHI牌)测定其在游泳的前5min内所呈现的不动状态时间总和。24h后,在同样条件下又使动物游泳5min(第2次试验),测定此期间内的不动状态时间总和。第2次试验中的不动状态时间总和长于第1次试验的前5min内者定为BD组。2.免疫组化染色BD试验结束后第2小时,用1%戊巴比妥钠腹腔内麻醉动物,经左心室和升主动脉先以生理盐水冲洗,继而用pH7.4、含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐液(PBS)灌注固定。取脑,脑块放入灌注液进行后固定4h,再放入含30%蔗糖的PBS至下沉。振动切片(4℃),片厚40μm,从嗅结节至三叉神经根平面连续横切。切片分为3套,第1套切片按抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶(ABC)法进行抗fos蛋白免疫组化染色:以下每一步骤结束后均用PBS洗3次,每次15min。第1套切片放入:(1)0.3%H2O2孵育10min;(2)兔抗c-fos(fos蛋白抗体,OncogeneScience公司,1∶500)、0.3%tritonX-100、正常羊和牛血清中孵育24h(4℃);(3)生物素标记的羊抗兔IgG(VECTOR公司,1∶200)中孵育1h(室温);(4)ABC(VECTOR公司,1∶500)中孵育1h(室温);(5)在含有0.02%二氨基联苯胺、0.04%NiCl2和0.005%H2O2的NaH2PO4溶液中成色5~7min(室温)。第2套切片用1%中性红染色。第3套切片做免疫组化对照试验:用0.01mol的PBS代替第1级抗体,按ABC法进行。40倍光镜下观察和计数各部位内FLI神经元及其数目。3.fli神经元数目的比较两组不动状态时间的比较,用t′检验;FLI神经元数目的比较按部位(参照Paxinos等编制的1986年版大鼠脑图谱,)用单因素方差分析。结果一、未用于本研究20只实验组动物中,10只(占50%)因在第2次试验中的不动状态时间短于或等于第1次试验而未用于本研究。其余的BD组与对照组的不动状态时间分别为(222.2±11.5)s和(62.1±1.7)s,差异有非常显著性(t′=44.87,t′0.01=3.25,t′>t′0.01,P<0.01)。二、fli神经元FLI产物经NiCl2强化后呈黑色、颗粒状,光镜下显示其主要分布于胞核,胞核染成黑色的细胞即为FLI神经元。核的染色有深、中、浅等3种。对照组FLI神经元分布于额、顶、梨状、扣带皮质,隔外侧核,尾壳核,屏状核,杏仁核,海马,丘脑室旁核,下丘脑室旁核、室周核、视上核,中脑中央灰质,蓝斑等部位;染色深度以中、浅两种为主。BD组与对照组比较,40倍光镜下FLI神经元数目在前额内侧皮质、隔外侧核、下丘脑室旁核、下丘脑外侧区、中脑中央灰质、中脑网状结构、中缝背核BD组明显增加(表1),染色深度以深、中2种为主。神经功能障碍将BD模型动物在水中的不动状态时间总和作为其行为学观察指标,而这种不动状态时间特异性地只被各种抗抑郁疗法所缩短,故本模型适用于抗抑郁药筛选试验和抑郁症的生物学研究。我们认为,本模型具有制作方法简便、效度和信度较高等特点。fos蛋白是即刻早期表达基因c-fos编码产生的一种核蛋白,具有当机体受到外界刺激时在神经系统内迅速出现的特性。因此,利用fos蛋白抗体的免疫组化法有助于在细胞水平探讨各种精神障碍的发病机制。Bang等报道(观察部位限于端脑和间脑),与对照组比较,BD组前额内侧皮质、隔外侧核、下丘脑室旁核等部位内的FLI神经元数目增加,这与我们的部分结果一致。但本结果还显示,除端脑和间脑外,BD组下丘脑外侧区、中脑中央灰质、中脑网状结构、中缝背核内FLI神经元数目也增加。上述的BD组脑内FLI神经元数目增加的这些部位,均是与情感活动关系密切的部位,它们均发出纤维加入到前脑内侧束,从而参加脑内犒赏系统(rewardsystem)的构成。在本结果中,BD组额皮质V层、中脑网状结构和中缝背核内可见到胞核深染、胞浆浅染的FLI神经元胞体,提示这些神经元有变性性改变。其机制可能与应激所致神经元强烈而持续的兴奋引起细胞内Ca2+过载有关。据文献报道,在强制步行模型、慢性应激模型等其它抑郁症动物模型中,也已找到犒赏系统内一些神经元结构受损的证据或线索。犒赏系统受损