心绞痛大鼠中枢nadph亚基gp91phox表达的变化

心绞痛大鼠中枢nadph亚基gp91phox表达的变化

心绞痛是心血管系统中最常见的疾病之一，严重危害人类健康。我们一直在研究心绞痛的发生和发展机制，并采取措施缩短或逆转心绞痛的病理过程。尽管目前治疗手段很多,其发病率及病死率却居高不下,说明仍存在尚不清楚的因素。近年来,越来越多的研究证实中枢调控在心血管疾病发生发展中起着重要作用。在中枢神经系统中,过多超氧化物引起的氧化应激会影响心血管中枢稳态进而引发各种心血管疾病。而现阶段更多的研究表明,中枢超氧化物(及相关的活性氧簇)在心血管疾病发生发展中起着至关重要的作用。本实验采用冠脉结扎诱导大鼠心绞痛模型,观察心绞痛时中枢氧化应激水平变化,并运用NADPH氧化酶抑制剂APO减弱中枢氧化应激进而改善心绞痛时心功能。1材料和方法1.1左心肌梗死前降支诱导心绞痛模型本实验采用雄性健康Sprage-Dawley(SD)大鼠,体重200g±50g,饲养于室温(23±2)℃和光照控制12h,不限制饮食和饮水。采用结扎左冠状动脉前降支诱导心绞痛模型,假手术组仅进行手术而不造成缺血状态。手术后大鼠固定于脑立体定位仪上进行侧脑室插管,用于干预处理。剪开头部皮肤暴露颅骨,以前囟为中心,中线右侧0.13cm,尾侧0.08cm定位,用钻头钻开颅骨,深度为由硬脑膜起0.35cm。插管由牙托粉固定,干预组给予APO(Sigma公司,60μg/3min),对照组给予人工脑脊液。雄性Sprage-Dawley大鼠随机分为心绞痛干预组、心绞痛对照组、假手术干预组和假手术对照组。1.2左心室内压和心率测定2h后各组大鼠(每组12只)随机抽取6只进行血流动力学检测。大鼠经称重麻醉(戊巴比妥钠30mg/kg)后置于手术台上,分离颈部组织暴露右侧颈总动脉,将颈动脉插管经右颈总动脉插入左心室,稳定15min后记录(BL-420S生物信号记录系统成都泰盟)左心室舒张末压(LVEDP)、左心室内压最大上升速率(LV+dp/dtmax)、左心室内压最大下降速率(LV-dp/dtmax)和心率(HR)。记录结束后处死大鼠,迅速采集心脏、肺组织,经冷生理盐水冲洗后用滤纸沥干。分离右心室(包括室间隔),右心室与肺组织分别称重并与体重相除,计算其相对值。脑组织取出后用锡箔纸包裹,置于-70℃冰箱保存。1.3开嘴唇,开u30002h后各小组大鼠(6只)经麻醉(戊巴比妥钠30mg/kg)后置于灌流手术台,打开胸腔,用16号针头经心尖穿刺进入主动脉。先用500mL生理盐水冲干净组织中的血液,再用4%多聚甲醛溶液500mL缓慢灌流充分固定组织。灌流完毕迅速取脑组织置于4%多聚甲醛固定4h后取出,再放入30%蔗糖溶液中脱水,待组织沉底即可用于冰冻切片或-70℃冰箱保存备用。1.4对内源性过氧化物酶的消除4%多聚甲醛灌注固定并经蔗糖脱水的脑组织,截取下丘脑部分放入冰冻切片机做冠状切片,片厚13μm,切片后室温晾干。采用SABC三步法检测脑组织下丘脑室旁核区NADPH亚基gp91phox表达。切片经0.3%过氧化氢作用10min,消除内源性过氧化物酶;PBS冲洗3次,每次3min;Triton37℃孵育1h,PBS冲洗3次,每次3min;滴加5%绵羊血清37℃孵育10min封闭非特异性抗原;倾掉绵羊血清后滴加小鼠抗大鼠gp91phox单克隆抗体(1∶100,美国santacruz公司),4℃过夜;PBS冲洗3次,每次3min;滴加山羊抗小鼠Ⅱ抗(武汉博士德公司),37℃孵育30min;PBS冲洗3次,每次3min;再加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素37℃孵育30min;DAB显色剂显色,显色满意后自来水迅速冲洗终止显色;之后常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片,利用图像分析系统进行分析。阴性对照采用PBS代替一抗。1.5统计分析方法采用SPSS11.5统计学软件进行统计分析。数据以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,采用t检验,P<0.05为有统计学意义。2结果2.1心绞痛干预组与假手术组心功能分级指标的比较心绞痛对照组左室舒张末压(LVEDP)明显高于假手术对照组(P<0.05),LV+dp/dtmax及LV-dp/dtmax绝对值显著低于假手术对照组(P<0.05),心绞痛干预组心功能有所改善,LVEDP有所下降,LV+dp/dtmax及LV-dp/dtmax有所上升,与心绞痛对照组比较有统计学意义(P<0.05)。心绞痛组大鼠的右室/体重指数高于假手术组(P<0.05),说明有右心室肥大;肺脏/体重指数高于假手术组(P<0.05),说明有肺水肿发生。心绞痛干预组右心室/体重比值和肺/体重比值较心绞痛对照组有所降低,但仍未恢复到假手术组水平。详见表1。2.2apo干预前后gp21phon水平心绞痛对照组与假手术组相比下丘脑室旁核内gp91phox表达明显增加(棕黄色颗粒)(P<0.05),APO干预后gp91phox水平下降,与心绞痛对照组相比有统计学意义(P<0.05)。假手术两组之间无统计学意义。心绞痛时下丘脑室旁核氧化应激水平增高,APO降低了心绞痛大鼠下丘脑室旁核gp91phox的表达。3pao和apo对心血管正常心功能的影响心肌梗死引起心绞痛是急性心肌梗死患者常见死亡原因。绝大多数心绞痛患者冠脉内均可见有血栓形成使管腔狭窄,同时大量化学物质(缓激肽、腺苷、前列环素等)释放入外周血液。这些化学物质可与心脏上化学敏感受体结合,进而激活中枢痛觉传导通路。先前研究仅局限于循环系统,如心室重构、血流动力学改变等。越来越多的研究发现,中枢神经系统参与了心绞痛的发病机制。神经激素类物质,如血管紧张素、炎性细胞因子等可刺激下丘脑室旁核NADPH氧化酶催化产生超氧化物。同时,细胞线粒体内NADPH通路也可产生超氧化物。这些超氧化物是脑内重要的信号分子,在正常生理情况下,机体通过超氧化物生成和抗氧化系统(主要包括:酶类、低分子量抗氧化剂、激素类抗氧化剂、DNA修复系统等)将其维持在一个动态平衡状态。而当这种平衡状态被破坏,即超氧化物产生过多,且未能被抗氧化系统及时清理,就会引起中枢氧化应激,进而对机体产生各种危害。本实验中采用侧脑室给予NADPH氧化酶抑制剂APO,来验证中枢氧化应激在心绞痛中的作用。免疫组化实验结果表明心绞痛对照组大鼠下丘脑室旁核内gp91phox表达明显增加。运用APO治疗后心绞痛大鼠下丘脑室旁核gp91phox表达下降,同时心功能明显改善。心绞痛干预组大鼠比心绞痛干预组大鼠左室舒张末压降低,左室压力最大上升速率及最大下降速率均有所上升。肺体重比值减小,提示肺淤血减轻,